低表達FADS1基因可通過線粒體途徑促進結(jié)直腸癌細胞的發(fā)展.pdf

1、目的：
　　結(jié)直腸癌是人類常見的消化系統(tǒng)癌癥之一。特別是近幾年，結(jié)直腸癌的發(fā)病率不斷上升。結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素作用且過程復雜的病理過程。人口的老齡化，遺傳因素、危險因素的增加（如肥胖、吸煙、飲酒）以及不利的現(xiàn)代飲食習慣與結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。而脂肪酸代謝作為人體內(nèi)重要的代謝途徑，它與腫瘤的關(guān)系一直是研究的熱點。多不飽和脂肪酸作為脂肪酸代謝重要的組成部分，它的改變必將會對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展產(chǎn)生重大影響。本課題組長期致

2、力于脂肪酸代謝與結(jié)直腸癌關(guān)系的研究。課題組前期通過對結(jié)直腸癌病人血清樣本的代謝譜分析，發(fā)現(xiàn)與多不飽和脂肪酸代謝相關(guān)的通路出現(xiàn)異常。同時發(fā)現(xiàn)多不飽和脂肪酸對結(jié)直腸癌細胞的生長、遷移、侵襲等多方面有影響。本實驗課題為了探究脂肪酸代謝的變化對結(jié)直腸癌的影響，從脂肪酸的重要組成部分--多不飽和脂肪酸入手，以多不飽和脂肪酸代謝通路關(guān)鍵酶FADS1基因為切入點，設計實驗使FADS1蛋白的表達下降從而抑制多不飽和脂肪酸的合成，其目的在于觀察FADS1

3、蛋白表達量的降低對結(jié)直腸癌細胞的影響，以便探尋FADS1基因以及多不飽和脂肪酸在結(jié)直腸癌中的作用，為結(jié)直腸癌的臨床治療提供新思路。
　　方法：
　　1、使用 life technology公司提供的RNAi功能模塊設計兩條 shRNA，進行質(zhì)粒重組后，利用含有FADS1shRNA的重組質(zhì)粒對結(jié)直腸癌細胞DLD-1進行轉(zhuǎn)染，并通過G418的篩選得到FADS1穩(wěn)定敲低的細胞株。
　　2、將FADS1KD細胞株進行細胞功能實

4、驗，分析FADS1KD細胞株與對照細胞株細胞功能的差異。
　?。?）利用CCK-8試劑盒測定FADS1KD細胞株和對照細胞株的增殖速度，繪制增殖曲線；
　?。?）在六孔板內(nèi)接種少量細胞，長時間培養(yǎng)后，檢測FADS1KD細胞株和對照細胞株單個細胞形成細胞克隆的能力；
　　（3）同等條件下觀察FADS1KD細胞株和對照細胞株對劃痕的修復能力；
　?。?）利用Transwell小室測定FADS1KD細胞株和對照細胞株的

5、遷移能力；
　?。?）利用基質(zhì)膠模仿細胞外基質(zhì)，在Transwell小室中測定FADS1KD細胞株和對照細胞株的侵襲能力。
　　3、大量培養(yǎng)結(jié)直腸癌細胞，進行線粒體提取，再利用超高速離心分離線粒體膜和基質(zhì)，最后利用Glycine-SDS-PAGE電泳技術(shù)來確定FADS1蛋白在細胞和線粒體內(nèi)的定位情況。
　　4、在FADS1KD細胞株密度達到50-60％時，進行線粒體功能實驗，分析FADS1KD細胞株和對照細胞株線粒體功

6、能的差異。
　　（1）利用多功能酶標儀和ROS檢測試劑盒檢測FADS1KD細胞株和對照細胞株線粒體ROS生成量；
　　（2）利用多功能酶標儀和TMRM熒光染料檢測FADS1KD細胞株和對照細胞株線粒體膜電位水平；
　　（3）利用多功能酶標儀和ATP檢測試劑盒檢測FADS1KD細胞株和對照細胞株ATP生成量。
　　5、利用Glycine-SDS-PAGE電泳技術(shù)對FADS1KD細胞株和對照細胞株內(nèi)與線粒體凋亡相關(guān)的

7、蛋白進行表達量的分析，主要檢測BAX/BCL-XL的變化。
　　6、通過對所收集的臨床組織的石蠟切片進行免疫染色，根據(jù)染色的深淺來反應FADS1基因在組織中的表達強度，對細胞實驗的結(jié)果進行驗證。
　　結(jié)果：
　　1、通過RNA干擾，兩條shRNA都可以使FADS1KD細胞株中FADS1的表達量明顯下降。
　　2、FADS1KD細胞株中，KD-2增殖速度明顯增加，而KD-1增殖速度無顯著性差異。3、FADS1KD細

8、胞株與正常對照相比，單個細胞形成克隆的能力增加，F(xiàn)ADS1KD細胞株形成的細胞克隆數(shù)量更多，體積更大。
　　4、FADS1KD細胞株與正常對照相比，對劃痕的修復能力更強。
　　5、FADS1KD細胞株無論是在遷移還是侵襲實驗中，穿過小室的細胞數(shù)都明顯多于正常對照組。
　　6、提取線粒體后，以正常完整結(jié)直腸癌細胞為對照，證明FADS1蛋白在細胞內(nèi)定位于線粒體。將單獨線粒體裂解后，通過高速離心分離膜和基質(zhì)，發(fā)現(xiàn)FADS1在

9、線粒體的膜和基質(zhì)中同時存在。
　　7、FADS1KD細胞株與正常對照相比，線粒體內(nèi)的ROS呈顯著性降低。
　　8、FADS1KD細胞株與正常對照相比，線粒體膜電位水平、ATP生成量均有所上升。
　　9、在FADS1KD細胞株中，線粒體凋亡相關(guān)蛋白BAX的表達量下降而BCL-XL的表達量上升。
　　10、在結(jié)直腸癌組織石蠟切片中，原發(fā)癌與癌旁正常組織相比，F(xiàn)ADS1的表達量下降，而轉(zhuǎn)移癌與原發(fā)癌相比，F(xiàn)ADS1表達