大鼠TGFβⅡ型受體胞外區(qū)與IFN-γ融合蛋白表達(dá)及其抗大鼠肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝纖維化是指肝細(xì)胞發(fā)生壞死及炎癥刺激時(shí)，肝臟內(nèi)纖維結(jié)締組織異常增生的病理過(guò)程，其主要的病理特征為細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)在肝Disse間隙的過(guò)度沉積?；罨母涡菭罴?xì)胞(hepaticstellatecell，HSC)是肝纖維化發(fā)生時(shí)主要的ECM合成細(xì)胞，其活化過(guò)程主要由轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGFβ介導(dǎo)。因而TGFβ/HSC軸作為潛在的抗肝纖維化治療靶點(diǎn)，受到眾多研究者重視。TGFβ發(fā)揮生物學(xué)作用須與細(xì)胞表面T

2、GFβ受體(TβR)結(jié)合。而缺陷型TGFβⅡ型受體(dominant-negativeTβR)、可溶性TβRⅡ(solubleTGFβRⅡ，sTβRⅡ)的共同點(diǎn)是均可結(jié)合TGFβ而不能啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。另有研究表明，IFN-γ在體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中均抑制HSC活化、減輕動(dòng)物肝纖維化程度，其機(jī)制為通過(guò)JAK/STAT途徑誘導(dǎo)Smad7表達(dá)、抑制TGFβ受體復(fù)合物與Smad3的相互作用，從而間接抑制TGFβ生物學(xué)活性、抑制HSC活化。因而sTβRⅡ

3、和IFN-γ能在不同位點(diǎn)阻斷TGFβ1的生物學(xué)活性、抑制HSC活化，兩者聯(lián)合應(yīng)用可能在抗肝纖維化中具有潛在的協(xié)同作用，并因減少了各自用量而降低副作用。 細(xì)胞因子重組融合蛋白是一類利用基因工程的方法將編碼細(xì)胞因子和其他有特定功能的蛋白分子基因序列連接并表達(dá)相應(yīng)蛋白質(zhì)融合產(chǎn)物，其生物學(xué)活性較各單體大大增強(qiáng)。 為探討sTβRⅡ和IFN-γ在抗肝纖維化中潛在的協(xié)同作用及融合表達(dá)對(duì)細(xì)胞因子活性的增強(qiáng)作用，本研究在國(guó)內(nèi)外首次構(gòu)建了穩(wěn)

4、定表達(dá)大鼠TGFβⅡ型受體胞外區(qū)與IFN-γ融合蛋白(ratsolublesTβRⅡ-IFN-γ，RsTβRⅡ-IFN-γ)的原核表達(dá)系統(tǒng)，并大量擴(kuò)增、純化融合蛋白以及鑒定它的生物學(xué)活性。通過(guò)融合蛋白體內(nèi)抗大鼠肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究證明大鼠sTβRⅡ(ratsolubleTGFβRⅡ，RsTβRⅡ)和大鼠IFN-γ(ratIFN-γ，RIFN-γ)融合表達(dá)可使兩者發(fā)揮一定的協(xié)同作用，為新型抗肝纖維化藥物研究奠定了基礎(chǔ)。下文中sTβRⅡ和IF

5、N-γ除特別注明外，均為大鼠來(lái)源。 PartⅠ.大鼠sTβRⅡ-IFN-γ融合蛋白原核表達(dá)、純化及生物學(xué)活性鑒定本研究以已在CHO細(xì)胞中成功表達(dá)RsTβRⅡ-IFN-γ融合蛋白的pSecTag2/RsTβRⅡ-IFN-γ真核表達(dá)載體為模板用PCR擴(kuò)增RsTβRⅡ-IFN-γ融合片段，并將編碼RsTβRⅡ-IFN-γ的序列亞克隆至pET44原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)菌，抽提pET-44a(+)/RsTβRⅡ-IFN-γ重組

6、體質(zhì)粒DNA，經(jīng)酶切鑒定后，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)菌，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)RsTβRⅡ-IFN-γ融合蛋白，并分別采用WesternBlotting和ELISA方法檢測(cè)RsTβRⅡ-IFN-γ融合蛋白，證實(shí)其中含有可同時(shí)與RsTβRⅡ抗體和RIFN-γ抗體發(fā)生特異性反應(yīng)的目的蛋白。為了獲得純度較高的RsTβRⅡ-IFN-γ融合蛋白，本研究對(duì)此融合蛋白進(jìn)行了純化。 為檢驗(yàn)該融合蛋白的RsTβRⅡ和RIFN-γ的生物學(xué)活性，分

7、別采用抗TGFβ1增殖抑制實(shí)驗(yàn)和抗病毒活性實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)中，TGFβ1對(duì)CCL-64細(xì)胞增殖抑制作用可被RsTβRⅡ-IFN-γ融合蛋白拮抗，且具有濃度依賴關(guān)系，證明RsTβRⅡ-IFN-γ融合蛋白具有sTβRⅡ的生物學(xué)活性；在抗病毒活性實(shí)驗(yàn)中，無(wú)RsTβRⅡ-IFN-γ保護(hù)的L929細(xì)胞在一定濃度的VSV攻擊下24小時(shí)內(nèi)即出現(xiàn)典型的病毒感染跡象，而經(jīng)RsTβRⅡ-IFN-γ融合蛋白預(yù)先處理的L929細(xì)胞抵御VSV攻擊的能力大為增強(qiáng)，且R

8、sTβRⅡ-IFN-γ保護(hù)力與其濃度有依賴關(guān)系。說(shuō)明RsTβRⅡ-IFN-γ融合蛋白具有IFN-γ的抗病毒活性。 結(jié)論：本研究成功構(gòu)建了表達(dá)大鼠sTβRⅡ-IFN-γ融合蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-44a(+)/RsTβRⅡ-IFN-γ，并在原核細(xì)胞中表達(dá)出同時(shí)具有RsTβRⅡ和RIFN-γ生物學(xué)活性的重組融合蛋白R(shí)sTβRⅡ-IFN-γ。純化了重組RsTβRⅡ-IFN-γ融合蛋白、RsTβRⅡ蛋白，且純化后蛋白的生物學(xué)活性沒(méi)有破

9、壞。 PartⅡ.大鼠sTβRⅡ-IFN-γ融合蛋白抗大鼠肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究為進(jìn)一步研究RsTβRⅡ-IFN-γ重組融合蛋白的體內(nèi)抗肝纖維化作用，采用融合蛋白直接肌肉注射的方法治療四氯化碳(tetrachloridecarbon，CCl4)誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型，觀察RsTβRⅡ/RIFN-γ在體內(nèi)抗肝纖維化中可能具有的協(xié)同作用。 首先用四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)建立了大鼠持續(xù)性肝纖維化模型，該方法操作較膽管結(jié)扎(BDL)

10、簡(jiǎn)便，費(fèi)用低，病變典型。預(yù)實(shí)驗(yàn)中，大鼠給予皮下注射50％CCl4(茶油配制)、0.3ml/100g體重、每周2次、連續(xù)8周，停止給藥行肝臟組織病理學(xué)檢查，見(jiàn)大鼠肝臟呈現(xiàn)明顯纖維化改變，且停止CCl4給藥5周后，再行組織病理學(xué)檢查肝纖維化程度未見(jiàn)明顯減輕，表明CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，自愈現(xiàn)象不明顯，纖維化模型合格。正式實(shí)驗(yàn)中我們沿用了同樣的方法誘導(dǎo)大鼠肝纖維化。 在動(dòng)物模型建立以后，將其隨機(jī)分組后分別給予RsTβRⅡ-

11、IFN-γ重組融合蛋白、RIFN-γ和RsTβRⅡ蛋白、RIFN-γ+RsTβRⅡ蛋白治療，并以未處理的肝纖維化組和正常組大鼠為對(duì)照。 治療結(jié)束后兩周處死所有大鼠，取肝臟做HE染色、膠原天狼紅染色，并用免疫組織化學(xué)、WesternBlotting、熒光定量RT-PCR檢測(cè)肝組織中Ⅲ型膠原、α-SMA、TGFβ1、TβRⅡ等分子的表達(dá)。結(jié)果顯示，RsTβRⅡ-IFN-γ重組融合蛋白治療組這四種蛋白的含量及其mRNA的表達(dá)量均明顯少

12、于其余各組。更直接的肝臟組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示RsTβRⅡ-IFN-γ治療組肝纖維化程度較其余各組明顯減輕，說(shuō)明RsTβRⅡ/RIFN-γ融合表達(dá)較單獨(dú)RsTβRⅡ、RIFN-γ或RsTβRⅡ與RIFN-γ混合應(yīng)用具有更顯著的抗肝纖維化作用，證明RsTβRⅡ/RIFN-γ融合表達(dá)在抗HSC活化、減少其ECM蛋白表達(dá)及抗肝纖維化中具有協(xié)同作用。 結(jié)論：用RsTβRⅡ-IFN-γ融合蛋白治療大鼠肝纖維化，能明顯減少CCl4誘導(dǎo)的大鼠