α-酮戊二酸二甲酯對(duì)肝星狀細(xì)胞活化及肝纖維化的影響及機(jī)制研究.pdf

1、肝纖維化是肝組織的損傷修復(fù)反應(yīng)過(guò)程，是以Ⅰ型膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)在肝組織的的凈沉積。肝纖維化是各種慢性肝病的共同病理變化特征，是各種慢性肝病進(jìn)展為肝硬化的必經(jīng)病理階段。而肝硬化治療困難、死亡率高。因此，調(diào)控肝纖維化對(duì)改善慢性肝病預(yù)后至關(guān)重要，并且已成為研究的熱點(diǎn)。
　　在肝損傷時(shí)，活化的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)是造成細(xì)胞外基質(zhì)沉積的主要細(xì)胞。在正常肝臟中，HSC處于靜止?fàn)顟B(tài)，存在于Disse

2、間隙。靜止?fàn)顟B(tài)的HSC富含大量脂滴，其主要由脂肪酸、甘油三酯和維生素A等組成。在肝損傷發(fā)生時(shí)，HSC在旁分泌信號(hào)的作用下發(fā)生活化，細(xì)胞內(nèi)脂滴丟失，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞表型;獲得收縮、遷移、促纖維化等新特性;并開(kāi)始表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA)，分泌以Ⅰ型膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)并造成細(xì)胞外基質(zhì)的凈沉積。活化的HSC是肝纖維化發(fā)生及進(jìn)展的關(guān)鍵細(xì)胞。因此，如何抑制HSC的活化成為治療肝纖維

3、化研究的重要方向。
　　自噬（通常所說(shuō)的自噬泛指巨自噬，本文中的自噬亦均指巨自噬）是真核細(xì)胞在進(jìn)化過(guò)程中的一種高度保守的代謝機(jī)制。自噬發(fā)生時(shí)，細(xì)胞通過(guò)雙層膜包裹細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞器、脂滴等成分形成自噬體，隨后在自噬體與溶酶體融合之后包裹的內(nèi)容物被溶酶體降解，營(yíng)養(yǎng)成分和所產(chǎn)生的能量則重新被細(xì)胞利用。自噬作為一種分解代謝過(guò)程對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。HSC的活化和細(xì)胞外基質(zhì)的合成、分泌均是耗能過(guò)程，需要持續(xù)的的能量供應(yīng)。研究證實(shí)，HSC活

4、化時(shí)自噬將細(xì)胞內(nèi)的脂滴吞噬、分解并釋放脂肪酸，后者經(jīng)β氧化作用生成ATP;此過(guò)程是HSC活化主要的能量來(lái)源;阻斷自噬可抑制HSC的活化。但常用的自噬抑制劑因長(zhǎng)期體內(nèi)應(yīng)用時(shí)常導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)，而在治療肝纖維化的應(yīng)用中受到限制。因此，如何有效且安全地抑制HSC自噬成為抑制HSC活化研究的重要課題。
　　α-酮戊二酸是細(xì)胞內(nèi)的一種天然成分，主要參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的的代謝過(guò)程，對(duì)其調(diào)控的安全性較高。近年多項(xiàng)研究證實(shí)改變細(xì)胞內(nèi)的α-酮戊二酸水平

5、可調(diào)控細(xì)胞的自噬，但可能因?yàn)檫@些研究涉及的細(xì)胞類型各異，目前尚無(wú)一致的研究的結(jié)論。并且在本實(shí)驗(yàn)之前，尚無(wú)通過(guò)改變?chǔ)?酮戊二酸水平調(diào)控HSC自噬或活化的研究。α-酮戊二酸二甲酯(dimethylα-ketoglutarate，DMKG)是α-酮戊二酸水平調(diào)控研究的常用試劑。相對(duì)于α-酮戊二酸本身，DMKG更易通過(guò)細(xì)胞膜。DMKG進(jìn)入細(xì)胞后將迅速被細(xì)胞內(nèi)的酯酶分解并生成α-酮戊二酸，從而顯著提高細(xì)胞內(nèi)α-酮戊二酸水平。
　　本實(shí)驗(yàn)研究

6、了DMKG對(duì)HSC活化及肝纖維化的影響，并驗(yàn)證該影響是否與自噬有關(guān)聯(lián)，另外我們也對(duì)DMKG影響HSC自噬的可能機(jī)制進(jìn)行了探索。
　　第一部分:體外實(shí)驗(yàn)中DMKG對(duì)HSC的活化的影響
　　目的:
　　體外實(shí)驗(yàn)中，利用MTT法檢測(cè)梯度濃度的DMKG對(duì)肝細(xì)胞系、活化的HSC細(xì)胞系生存率的影響，篩選出不影響兩種細(xì)胞系生存率的DMKG安全濃度范圍?；罨硇偷腍SC細(xì)胞系在添加上述安全濃度的DMKG培養(yǎng)后，利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR

7、法及western-blot法檢測(cè)HSC活化指標(biāo)的表達(dá)變化，評(píng)估DMKG對(duì)HSC活化的影響。
　　方法:
　　1.采用肝星狀細(xì)胞系HSC-T6和肝細(xì)胞系BRL-3A進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。HSC-T6為永生活化表型。兩者均用高糖DMEM+10％胎牛血清常規(guī)培養(yǎng)。
　　2.向HSC-T6和BRL-3A細(xì)胞系的培養(yǎng)基中加入梯度濃度的DMKG(0-32mM)，培養(yǎng)24小時(shí)后，利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存率，并進(jìn)行定量分析。
　　3.用上

8、述方法探索得到不影響兩種細(xì)胞生存率的DMKG濃度范圍，向HSC-T6細(xì)胞系培養(yǎng)基中加入上述濃度范圍內(nèi)的DMKG，并設(shè)置空白對(duì)照組，培養(yǎng)結(jié)束后，利用Trizol提取細(xì)胞總RNA，利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)HSC活化指標(biāo)Ⅰ型膠原、α-SMA的mRNA水平，并進(jìn)行相對(duì)定量分析。
　　4.向HSC-T6細(xì)胞系培養(yǎng)基中加入同上一步相同濃度的DMKG，并設(shè)置空白對(duì)照組，培養(yǎng)結(jié)束后，利用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，利用western-bl

9、ot法檢測(cè)HSC活化指標(biāo)Ⅰ型膠原、α-SMA的蛋白表達(dá)量，并進(jìn)行相對(duì)定量分析。
　　結(jié)果:
　　1.DMKG濃度在1-18 mM范圍內(nèi)時(shí)，對(duì)肝細(xì)胞生存率無(wú)顯著影響。DMKG濃度在20-32mM范圍內(nèi)時(shí)，對(duì)肝細(xì)胞生存率產(chǎn)生濃度依賴性抑制作用。
　　2.DMKG濃度在1-16 mM范圍內(nèi)時(shí)，對(duì)HSC的生存率無(wú)顯著影響。DMKG濃度在18-32mM范圍內(nèi)時(shí)，對(duì)HSC細(xì)胞生存率產(chǎn)生濃度依賴性抑制作用。
　　3.DMKG濃

10、度在18-32mM范圍內(nèi)時(shí)，對(duì)于同樣濃度的DMKG，HSC的生存率顯著低于肝細(xì)胞的生存率。
　　4.4mM濃度的DMKG能顯著下調(diào)HSC細(xì)胞α-SMA的mRNA水平;1mM及4mM濃度的DMKG均能顯著下調(diào)HSC細(xì)胞Ⅰ型膠原的mRNA水平。
　　5.1mM、4mM濃度的DMKG均可顯著抑制HSC細(xì)胞α-SMA和Ⅰ型膠原的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.低濃度(≤16mM)的DMKG短時(shí)間內(nèi)并不影響肝細(xì)胞及HSC的

11、生存率，且肝細(xì)胞比HSC對(duì)高濃度（≥18mM）DMKG的生存率抑制耐受性更好。
　　2.體外實(shí)驗(yàn)中，安全濃度范圍內(nèi)低濃度(1mM、4mM)的DMKG即可顯著抑制HSC的活化。
　　關(guān)鍵詞:HSC-T6細(xì)胞;α-酮戊二酸二甲酯;BRL-3A細(xì)胞;細(xì)胞生存率
　　第二部分:DMKG對(duì)CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型的影響
　　目的:
　　建立CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型，在造模期間腹腔注射DMKG，觀察DMKG

12、對(duì)肝纖維化程度及肝功能的影響。
　　方法:
　　1.動(dòng)物模型:6周齡成年雄性Wistar大鼠，將50％ CCl4橄欖油溶液1ml/kg(即CCl4，0.5ml/kg)每周兩次（周二、周四）大鼠腹腔注射，共9周。
　　2.藥物干預(yù)及分組:20只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、單純DMKG腹腔注射組、CCl4模型組、CCl4模型+DMKG腹腔注射干預(yù)組。每組5只。模型組造模方法如上所述。CCl4模型+DMKG腹腔注射干預(yù)組在造模之

13、日起，每周2次（周三、周五）DMKG200mg/kg（溶于2ml PBS）腹腔注射。單純DMKG注射組在給與以上劑量DMKG注射的同時(shí)，給與單純橄欖油0.5ml/kg腹腔注射。正常對(duì)照組，只給與相同劑量的橄欖油和PBS腹腔注射。滿9周時(shí)，所有大鼠全部處死并留取肝組織及血清標(biāo)本。
　　3.肝臟組織化學(xué)染色:新鮮大鼠肝組織福爾馬林溶液固定、石蠟包埋、并制成5μm厚石蠟切片。利用Masson復(fù)合染液、亮綠染液對(duì)石蠟切片進(jìn)行Masson染

14、色，顯微鏡下可見(jiàn)膠原纖維被染成綠色。利用苦味酸天狼星紅染液染液對(duì)石蠟切片進(jìn)行天狼星紅染色，染色后的組織切片在偏振光顯微鏡暗場(chǎng)下可見(jiàn)Ⅰ型膠原纖維緊密排列，顯示很強(qiáng)的雙折光性，為亮紅-亮橘紅色纖維。天狼星紅染色陽(yáng)性面積計(jì)算公式:天狼星紅陽(yáng)性面積/（照片面積-照片中管腔面積）×100％。
　　4.肝組織羥脯氨酸含量檢測(cè):利用比色法測(cè)定肝組織羥脯氨酸的含量，可以反映肝纖維化程度。肝組織研磨制成勻漿，用濃鹽酸進(jìn)行酸水解。水解后的樣品用氫氧化

15、鈉中和后，加入ehrlich試劑顯色，測(cè)量570 nm波長(zhǎng)吸光度值。根據(jù)羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并以此計(jì)算各樣本的羥脯氨酸含量。
　　5.肝功能檢測(cè):ALT、AST可反映肝細(xì)胞的損傷程度。利用相應(yīng)成品試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，操作依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
　　結(jié)果:
　　1.Masson染色和天狼猩紅染色均顯示CCl4模型+DMKG腹腔注射干預(yù)組的膠原纖維面積較CCl4模型組明顯減少。定量分析顯示，天狼猩紅染色陽(yáng)性面積減少了4

16、4％。
　　2.CCl4模型+DMKG腹腔注射干預(yù)組的肝組織羥脯氨酸含量較CCl4模型組顯著降低。
　　3.ALT與AST化驗(yàn)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組與單純DMKG腹腔注射組之間無(wú)顯著差別、CCl4模型組與CCl4模型+DMKG腹腔注射干預(yù)組之間無(wú)顯著差別。
　　結(jié)論:
　　1.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，DMKG可減輕CCl4肝纖維化模型的肝纖維化程度。
　　2.體內(nèi)應(yīng)用時(shí)，DMKG并不誘發(fā)或加重肝細(xì)胞損傷。
　　關(guān)鍵

17、詞:肝纖維化;四氯化碳;α-酮戊二酸二甲酯;膠原
　　第三部分:DMKG影響HSC活化及肝纖維化的機(jī)制研究
　　目的:
　　本部分實(shí)驗(yàn)將探討DMKG影響HSC活化的機(jī)制是否自噬有關(guān)。若有關(guān)聯(lián)，本部分還將對(duì)DMKG影響HSC自噬的可能機(jī)制進(jìn)行探索。
　　方法:
　　1.肝組織免疫熒光染色（雙標(biāo)）:α-SMA是HSC活化的標(biāo)記物，而在肝細(xì)胞并無(wú)表達(dá)。LC3B和Beclin-1均為反映自噬強(qiáng)度的指標(biāo)，與自噬呈正相

18、關(guān)。5μm厚的石蠟切片經(jīng)脫蠟處理后，煮沸行抗原修復(fù)。切片經(jīng)相應(yīng)的一抗（小鼠源抗α-SMA、兔源抗LC3B或Beclin-1）孵育過(guò)夜后，再用對(duì)應(yīng)的二抗（α-SMA對(duì)應(yīng)紅色熒光二抗、LC3B和Beclin-1對(duì)應(yīng)綠色熒光二抗）孵育。熒光顯微鏡下觀察并拍照。利用軟件對(duì)紅綠熒光強(qiáng)度、共定位關(guān)系進(jìn)行分析。
　　2.透射電子顯微鏡觀察自噬體是自噬檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。為明確DMKG對(duì)HSC自噬的影響， HSC-T6培養(yǎng)基內(nèi)加入DMKG培養(yǎng)后，對(duì)

19、細(xì)胞進(jìn)行固定并超薄切片，透射電子顯微鏡觀察自噬體并進(jìn)行定量分析。
　　3.3MA是經(jīng)典的自噬抑制劑。HSC-T6培養(yǎng)基內(nèi)分別加入DMKG、3MA培養(yǎng)后，提取細(xì)胞總蛋白。Western-blot檢測(cè)HSC活化指標(biāo)α-SMA、Ⅰ型膠原以及自噬指標(biāo)LC3B-Ⅱ/、Beclin-1的表達(dá)。通過(guò)對(duì)比DMKG與3MA對(duì)HSC自噬及活化的影響，明確自噬在DMKG影響HSC活化中的作用。
　　4.HSC-T6培養(yǎng)基內(nèi)加入DMKG培養(yǎng)后，對(duì)細(xì)

20、胞行油紅染色以顯示細(xì)胞內(nèi)的脂滴。對(duì)脂滴占細(xì)胞的面積進(jìn)行定量分析。
　　5.HSC-T6培養(yǎng)基內(nèi)加入DMKG培養(yǎng)后，利用ATP測(cè)定試劑盒對(duì)HSC細(xì)胞內(nèi)ATP水平進(jìn)行測(cè)定，操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
　　6.激活mTORC1可抑制自噬。S6核糖體蛋白作為mTORC1的下游底物，其磷酸化水平可較準(zhǔn)確地反映mTORC1的活性。向HSC-T6培養(yǎng)基加入DMKG培養(yǎng)后，western-blot檢測(cè)細(xì)胞S6蛋白總含量、磷酸化S6蛋白的含量

21、。計(jì)算S6蛋白的磷酸化水平，以評(píng)估DMKG對(duì)HSC細(xì)胞mTORC1活性的影響。
　　7.DMKG可增高細(xì)胞內(nèi)α-酮戊二酸的含量，而α-酮戊二酸可通過(guò)代謝途徑轉(zhuǎn)換為乙酰輔酶A。有文獻(xiàn)提示乙酰輔酶A可能增強(qiáng)組蛋白乙?；窫P300的活性，而另外的文獻(xiàn)則提示EP300可通過(guò)使部分自噬相關(guān)蛋白發(fā)生乙?；种谱允?。硫辛酸是DMKG之外的另外一種可提高細(xì)胞內(nèi)乙酰輔酶A水平的物質(zhì)，而c646是乙酰輔酶A對(duì)EP300作用的特異性阻斷劑。我們通過(guò)

22、向HSC-T6細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加DMKG、硫辛酸以及c646培養(yǎng)后，western-blot檢測(cè)自噬指標(biāo)LC3B、Beclin-1以及HSC活化指標(biāo)α-SMA和Ⅰ型膠原的蛋白表達(dá)水平。以明確DMKG抑制HSC自噬的機(jī)制，并進(jìn)一步驗(yàn)證DMKG通過(guò)抑制HSC自噬而抑制HSC活化的結(jié)論。
　　結(jié)果:
　　1.肝組織免疫熒光（雙標(biāo)）染色顯示，自噬指標(biāo)的熒光強(qiáng)度和HSC活化指標(biāo)的熒光強(qiáng)度在肝纖維化模型組均顯著增高，經(jīng)DMKG干預(yù)后兩者

23、均顯著下降。并且自噬指標(biāo)和HSC活化指標(biāo)存在顯著的共定位關(guān)系。說(shuō)明肝組織中HSC的活化與HSC自噬水平存在相關(guān)性，且均可被DMKG抑制。
　　2.透射電鏡觀察結(jié)果顯示，對(duì)照組HSC細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體。DMKG處理后，HSC細(xì)胞內(nèi)自噬體的數(shù)量顯著下降，即DMKG可抑制HSC的自噬。
　　3.HSC細(xì)胞DMKG處理組和3MA處理組，自噬指標(biāo)均出現(xiàn)顯著下降。更重要的是，HSC活化指標(biāo)的下降趨勢(shì)與自噬指標(biāo)的下降趨勢(shì)一致

24、。說(shuō)明DMKG通過(guò)抑制自噬而抑制HSC的活化。
　　4.之前有研究證實(shí)自噬促進(jìn)HSC細(xì)胞內(nèi)脂滴的丟失并將其分解生成ATP，以促進(jìn)HSC的活化。本實(shí)驗(yàn)油紅染色及ATP測(cè)定證實(shí)，DMKG可阻斷HSC脂滴的丟失并能下調(diào)細(xì)胞內(nèi)ATP水平。
　　5.DMKG對(duì)S6核糖體蛋白的磷酸化水平無(wú)顯著影響，即DMKG并不影響HSC的mTORC1活性。該結(jié)果說(shuō)明DMKG抑制HSC自噬的機(jī)制為非mTORC1依賴的途徑。
　　6.DMKG和硫辛

25、酸均是乙酰輔酶A的供體，結(jié)果顯示HSC的自噬既能被DMKG抑制也能被硫辛酸抑制;c646是乙酰輔酶A與EP300作用的特異性抑制劑，結(jié)果顯示c646能逆轉(zhuǎn)DMKG和硫辛酸對(duì)HSC自噬的抑制作用。該結(jié)果說(shuō)明DMKG通過(guò)乙酰輔酶A-EP300途徑抑制了HSC的自噬。另外，c646逆轉(zhuǎn)DMKG、硫辛酸對(duì)HSC自噬抑制作用的同時(shí)，兩者對(duì)HSC活化的抑制也被逆轉(zhuǎn)，這進(jìn)一步說(shuō)明DMKG通過(guò)抑制HSC自噬進(jìn)而抑制其活化。
　　結(jié)論: