線粒體滲透性轉(zhuǎn)變與乙肝病毒的復(fù)制的關(guān)系的研究.pdf

1、乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)引起的疾病，目前仍難以治愈，對(duì)人類(lèi)健康危害很大。HBV表達(dá)的一種非結(jié)構(gòu)蛋白HBx對(duì)HBV的復(fù)制十分重要，HBx可以通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)cd2+-Pyk2-Src信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而激活HBV的復(fù)制。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)HBx可以與線粒體外膜蛋白VDAC3相互作用，定位于線粒體上。線粒體的幾種蛋白質(zhì)在某些刺激下可以組成一種叫滲透性轉(zhuǎn)變孔復(fù)合體(permeability transition pore complex，PTP

2、C)的非特異性的通道，1500道爾頓以下的分子都可以自由進(jìn)出，導(dǎo)致線粒體滲透性轉(zhuǎn)變(mitochondrial permeabilitytransition，MPT)，VDAC曾被認(rèn)為參與組成PTPC。同時(shí)由于發(fā)現(xiàn)PTPC的抑制劑環(huán)胞霉素A(CsA)可以抑制HBV復(fù)制，所以有研究者提出一種假說(shuō)認(rèn)為HBx是依靠作用于線粒體上的PTPC誘導(dǎo)MPT，使線粒體釋放出Ca2+而激活Src信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最后激活HBV復(fù)制的。但是在HBV正常的復(fù)制狀態(tài)

3、下的HBx是否誘導(dǎo)MPT還沒(méi)有直接證據(jù)。CsA在細(xì)胞內(nèi)的靶位很多，并不是PTPC的專(zhuān)一性抑制劑。另外也有研究者發(fā)現(xiàn)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子也可以抑制HBV。因此上面的假說(shuō)仍需要更堅(jiān)實(shí)的證據(jù)。本論文在此基礎(chǔ)上，利用新的MPT檢測(cè)方法和RNA干擾技術(shù)對(duì)上面的問(wèn)題進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。
　　 本論文第一章的工作中，利用新的MPT的檢測(cè)方法--CalceinAM/CoCl2染色法，首先對(duì)HBV在HepG2細(xì)胞株中復(fù)制后對(duì)細(xì)胞MPT水平的影響進(jìn)

4、行研究，發(fā)現(xiàn)HBV復(fù)制后會(huì)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞線粒體滲透性轉(zhuǎn)變(MPT)。接著，我們又將HBx基因構(gòu)建入pCMV-HA真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HBx單獨(dú)表達(dá)同樣誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞MPT。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，HBV在細(xì)胞中復(fù)制確實(shí)會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞MPT，并且，這一現(xiàn)象與HBx蛋白相關(guān)。
　　 本論文第二章的工作中，為了專(zhuān)一性的抑制MPT，制備了用于沉默組成PTPC的幾種蛋白質(zhì)分子表達(dá)的esiRNA。首先克隆了Ant1、Ant2、V

5、dac3和CypD(Ppif)四個(gè)基因的片段，然后將它們分別以正向和反向連接到原核表達(dá)載體中間隔序列的兩側(cè)，使這些基因片段的正反義鏈在T7啟動(dòng)子的調(diào)控下轉(zhuǎn)錄，互補(bǔ)配對(duì)后形成長(zhǎng)雙鏈RNA(dsRNA)。不同基因的dsRNA分別用大腸桿菌的RNaseⅢ在Mn2+存在下酶切，純化得到21bp的esiRNA。將這四種esiRNA以及對(duì)照的esiRNA轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，利用半定量RT-PCR檢測(cè)esiRNA對(duì)不同基因mRNA水平的影響。結(jié)果顯

6、示四種esiRNA只引起目的基因mRNA的降解，而對(duì)其他同源基因的mRNA水平無(wú)影響。接著，我們選取esiANT1為重點(diǎn)研究對(duì)象，將esiANT1針對(duì)Ant1基因的靶向序列和與其對(duì)應(yīng)的Ant2和Ant3基因上的序列片段分別構(gòu)建到EGFP報(bào)告基因的3'UTR位置，然后將報(bào)告質(zhì)粒與esiANT1或化學(xué)合成的siANT1轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)EGFP的表達(dá)水平來(lái)探索esiANT1對(duì)同源性較高的Ant2、Ant3基因的表達(dá)是否有影響

7、。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明esiANT1與化學(xué)合成的siANT1一樣，可以高效的抑制3’UTR部分帶有Ant1序列的EGFP的表達(dá)，而對(duì)3’UTR部分帶有Ant2和Ant3序列的EGFP的表達(dá)沒(méi)有明顯的抑制作用，因此esiRNA既有很高的效能，又有足夠的特異性。
　　 本論文第三章的工作中，esiANT1、eSiANT2、esiVDAC3和esiCypD分別與pUC-HBV2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，使用Calcein-AM/CoCl2染色法

8、檢測(cè)PTPC開(kāi)放的情況，結(jié)果只有esiCypD能夠下調(diào)由HBV復(fù)制引起的PTPC開(kāi)放的水平。然后將esiCypD轉(zhuǎn)染整合了HBV基因組HepG2細(xì)胞株2.2.15，esiCypD也能下調(diào)由HBV復(fù)制引起的PTPC開(kāi)放的水平。接著，將上述四種esiRNA分別與pUC-HBV2共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，檢測(cè)HBV表面抗原和e抗原的表達(dá)以及HBVDNA的復(fù)制情況。結(jié)果表明，四種esiRNA對(duì)HBV表面抗原和e抗原的表達(dá)無(wú)影響，而esiANT1、e