非轉染人角膜基質(zhì)細胞系的建立、鑒定及其克隆化研究.pdf

1、角膜(cornea)是位于眼球最前部的一層透明膜，能為眼睛提供大部分的屈光力，加上晶體的屈光力，便可使光線準確聚焦在視網(wǎng)膜上成像。人角膜基質(zhì)(HumanCorneal Stroma.HCS)是角膜構成的主要部分，占角膜厚度的90％，在維持角膜透明及允許光線穿過中具有至關重要的作用。很多原因均可引起HCS發(fā)生異常性病變，且HCS病變具有患病率高、致盲性強和臨床治療困難等特點。目前唯一的治療辦法是進行角膜移植術，但由于捐獻角膜的高度匱乏，致

2、使絕大多數(shù)叫膜基質(zhì)異常患者因無法得到供體角膜而不能復明。近年來，角膜組織工程的興起使體外重建組織工程人角膜基質(zhì)(Tissue-Engineered Human Corneal Stroma，TE-HCS)成為可能，也給眾角膜基質(zhì)異常患者帶來了重見光明的希望。在TE-HCS的體外重建中，大量正常HCS種子細胞的來源和理想載體支架的獲得是急需解決的兩個關鍵問題，尤其是HCS種子細胞的來源問題更是制約TE-HCS規(guī)模化體外重建的瓶頸。雖然已有

3、利用癌基因轉染建立人角膜基質(zhì)人角膜基質(zhì)細胞(Human Corneal Stromal Cell，HCSC)細胞系的報道，但因這類細胞具有潛在致瘤性而無法應用于臨床，而建立非轉染、無致瘤性的HCSC細胞系被認為是解決大量正常HCS種子細胞來源問題的希望。但目前為止，仍未見成功建立非轉染、無致瘤性的HCSC細胞系有關報道。為了解決HCSC種子細胞來源問題，本文利用胰酶消化聯(lián)合組織塊貼壁法啟動了HCSC的原代培養(yǎng)，通過添加促貼壁、生長和分裂

4、的物質(zhì)獲得可繼代培養(yǎng)的HCSC，建立非轉染HCSC細胞系，并對其細胞屬性、功能蛋白表達和致瘤性進行鑒定，進而利用克隆化培養(yǎng)方法從此細胞系中篩選出單克隆細胞株，經(jīng)擴增培養(yǎng)后再次進行細胞屬性等鑒定，為利用細胞屬性正常的單克隆細胞株開展HCSC相關理論研究和TE-HCS的體外重建研究奠定基礎。
　　 為了建立非轉染HCSC細胞系，本文將撕除角膜內(nèi)皮層和上皮層得到的HCS片進行了胰蛋白酶適度消化，然后將組織塊平貼于用明膠包被的24孔板中

5、，加入含5％胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)的DMEM/F-12培養(yǎng)液置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中啟動原代培養(yǎng)。24 h后將培養(yǎng)液更換為HCSC專用培養(yǎng)液，即含有堿性成纖維細胞生長因子(Basic Fibroblast Growth Factor，bFGF)、表皮生長因子(EpidermalGrowth Factor，EGF)、硫酸軟骨素(Chondroitin Sulfate，CS)、羧甲基殼多糖(Carbox

6、ymethy1 Chitosan，CM-CH)和20％FBS的DMEM/F-12完全培養(yǎng)液。跟蹤觀察發(fā)現(xiàn)，啟動培養(yǎng)2 d后組織塊周圍開始有纖維樣細胞遷出，14 d便可長成完整的細胞單層，進而利用HCSC專用培養(yǎng)液成功進行了繼代培養(yǎng)。觀察結果顯示，HCSC貼壁能力強，在體外呈現(xiàn)穩(wěn)定的成纖維樣細胞形態(tài)，且生長分裂旺盛并能穩(wěn)定持續(xù)傳代，細胞經(jīng)凍存復蘇后依然保持良好的生長狀態(tài)和增殖能力，現(xiàn)已傳至第40代。
　　 為了鑒定所建立的非轉染H

7、CSC細胞系的屬性和潛能，本文對第40代HCSC細胞的形態(tài)、生長特性、核型以及功能蛋白的表達等進行了鑒定。細胞屬性檢測結果顯示，第40代HCSC依然呈典型的成纖維樣細胞形態(tài)，能活躍生長和分裂，其群體倍增時間為41.44 h，該細胞系細胞雖然出現(xiàn)了染色體的非整倍性，但其特征性染色體數(shù)目依然46條，并具有典型的人類染色體特征；對HCSC細胞系的免疫熒光檢測結果顯示，該細胞系細胞仍具有HCSC特異性標志蛋白--波形蛋白的陽性表達，綜合核型特征

8、可知，本文所建立的非轉染細胞系確為HCSC細胞系。為了鑒定所建立細胞系的潛能，本文又對該細胞系細胞進行了功能蛋白--細胞連接蛋白和膜運輸?shù)鞍妆磉_的免疫熒光檢測，發(fā)現(xiàn)該細胞系仍具有細胞連接蛋白--間隙連接蛋白CX-43和整聯(lián)蛋白β1的陽性表達，也保持有膜運輸?shù)鞍?-鈉鉀泵和鈣泵的陽性表達，表明該細胞系細胞仍具有形成細胞間以及細胞與細胞外基質(zhì)間細胞連接的潛能，還保持有對Na+、K+和Ca2+主動運輸?shù)臐撃?。可見，本文所建立的非轉染細胞系不僅

9、具有HCSC的屬性，而且還保持有細胞連接蛋白和膜運輸?shù)鞍椎年栃员磉_，具有行使正常HCSC功能的潛力。
　　 為了獲得可用于TE-HCS體外重建的核型正常的HCSC種子細胞，本文又利用克隆化培養(yǎng)技術對已建立非轉染HCSC細胞系進行了克隆化研究。利用有限稀釋法對HCSC細胞系進行了克隆化實驗，共獲得了15個單克隆細胞株，核型鑒定結果顯示，有3個單克隆細胞株的染色體數(shù)目為46條且具有正常二倍體核型。取其中一個單克隆細胞株C5G再次進行

10、生長特性的鑒定和標志蛋白表達的檢測。鑒定與檢測結果顯示，該單克隆細胞株細胞群體倍增時間為40.39 h，仍保持有旺盛的生長分裂活性，并具有波形蛋白的陽性表達，說明該細胞株確為HCSC單克隆細胞株，可被用作種子細胞進行TE-HCS及全層角膜的體外重建研究。
　　 綜上所述，本文成功建立了細胞屬性和功能蛋白表達正常的非轉染。HCSC細胞系，并從中篩選出了細胞屬性正常的單克隆細胞株，初步解決了足量HCSC種子細胞的來源問題，為TE-H