絨山羊皮膚絨毛生長(zhǎng)期與靜息期基因差異表達(dá)的研究.pdf

1、本項(xiàng)研究采用第二代超高通量DNA測(cè)序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)的方法，對(duì)來源于內(nèi)蒙古阿爾巴斯型白絨山羊的絨毛生長(zhǎng)期與靜息期三個(gè)皮膚部位的樣本進(jìn)行了深度的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并運(yùn)用denovo的方法對(duì)其皮膚轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行從頭組裝，隨后對(duì)這兩個(gè)時(shí)期所出現(xiàn)的差異表達(dá)基因進(jìn)行了深入系統(tǒng)的分析，以便更加深入地了解絨山羊絨毛生長(zhǎng)的分子機(jī)理，找出潛在的可能與絨毛生長(zhǎng)相關(guān)的基因，為今后進(jìn)一步進(jìn)行功能驗(yàn)證提供理論依據(jù)。
　　1.絨山羊皮膚轉(zhuǎn)錄組的高通量測(cè)序及denov

2、o組裝及組裝效果評(píng)估
　　在絨山羊絨毛生長(zhǎng)期和靜息期分別取兩只雌性阿爾巴斯絨山羊個(gè)體的腹部、體側(cè)和背部皮膚共計(jì)6個(gè)樣本，進(jìn)行RNA-Seq文庫(kù)的構(gòu)建和Illumina/Solexa高通量測(cè)序。共得到2億8千多萬條100bp的讀段，從頭組裝得到57，568條長(zhǎng)度大于300bp的轉(zhuǎn)錄本序列。這些轉(zhuǎn)錄本序列長(zhǎng)度總和達(dá)到53Megabase，平均長(zhǎng)度928bp，N50長(zhǎng)度1，397bp。將57，568條轉(zhuǎn)錄組序列與NCBI的非冗余蛋白數(shù)據(jù)

3、庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，其中有24，640條為陽(yáng)性。隨后對(duì)轉(zhuǎn)錄組序列的蛋白質(zhì)編碼區(qū)進(jìn)行從頭預(yù)測(cè)，共發(fā)現(xiàn)24，058個(gè)蛋白質(zhì)編碼序列。從頭預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)編碼序列數(shù)量與比對(duì)到數(shù)據(jù)庫(kù)中已知功能蛋白的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量非常接近。對(duì)隨機(jī)挑選的10條預(yù)測(cè)出具有全長(zhǎng)蛋白質(zhì)編碼區(qū)但在數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有同源物的轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)行RT-PCR和Sanger測(cè)序以驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組的組裝效果，發(fā)現(xiàn)有9條序列的PCR結(jié)果為陽(yáng)性，并且Sanger測(cè)序結(jié)果與denovo組裝后的序列比對(duì)后均存在98％以上

4、的相似度。此外，將用于denovo組裝的短序列重新定位回57，568條轉(zhuǎn)錄組序列，發(fā)現(xiàn)88.1％的序列可以發(fā)生單一定位，而其中的92.4％又屬于配對(duì)定位。以上結(jié)果表明組裝得到了較長(zhǎng)、質(zhì)量可靠且較全面的絨山羊皮膚轉(zhuǎn)錄組序列。
　　2.基于從頭組裝轉(zhuǎn)錄組序列的絨山羊不同絨毛生長(zhǎng)時(shí)期皮膚轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因分析
　　基于從頭組裝的轉(zhuǎn)錄組序列，我們對(duì)相同部位不同絨毛生長(zhǎng)時(shí)期的文庫(kù)進(jìn)行配對(duì)，并構(gòu)建了每個(gè)文庫(kù)的基因表達(dá)譜。隨后的差異基因表

5、達(dá)分析共獲得5，501條具有生物學(xué)重復(fù)的、一致性較好的差異表達(dá)基因。以絨山羊皮膚轉(zhuǎn)錄組為背景分別進(jìn)行差異表達(dá)基因的KEGG、KOG和GO的富集性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大量的胞外基質(zhì)組分和細(xì)胞骨架蛋白編碼基因出現(xiàn)在差異表達(dá)基因里，這些基因主要涉及胞外基質(zhì)-受體相互作用、黏著斑連接、間隙連接等通路中，揭示在絨毛生長(zhǎng)過程中細(xì)胞與細(xì)胞以及細(xì)胞與胞外基質(zhì)的相互作用對(duì)絨毛生長(zhǎng)是必須的。此外，很多信號(hào)通路中的生長(zhǎng)因子以及受體都被鑒定為差異表達(dá)基因，并且在絨毛

6、生長(zhǎng)期相對(duì)于靜息期是高表達(dá)基因。這些基因中很多都被證明是小鼠的毛囊建成以及發(fā)育所必須的。此外，對(duì)8個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示qPCR與高通量測(cè)序結(jié)果存在很高一致性，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的差異表達(dá)基因是可靠的。
　　3.基于山羊基因組的不同絨毛生長(zhǎng)時(shí)期皮膚基因差異表達(dá)分析及與前者的比較
　　基于最新測(cè)序的云南黑山羊基因組序列，我們對(duì)絨毛生長(zhǎng)期和靜息期的皮膚樣本進(jìn)行了基因差異表達(dá)分析。經(jīng)過文庫(kù)配比對(duì)對(duì)及進(jìn)一步的數(shù)據(jù)交