siRNA介導(dǎo)的雄激素受體抑制及其在肝癌細(xì)胞株細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、目的：AR在HCC的發(fā)病和發(fā)展中起著重要作用。AR可調(diào)節(jié)多個(gè)靶基因的表達(dá)。尚不清楚AR是否可以調(diào)節(jié)PEGl0和Caspase-12的表達(dá)。RNAi通過(guò)啟動(dòng)RNA雙鏈，特異性地降解相應(yīng)序列的靶mRNA而引起的同源基因表達(dá)沉默。在此，我們先在肝癌細(xì)胞株探討化學(xué)合成的siRNA雙鏈對(duì)AR的抑制作用，再探討AR對(duì)PEG 10和Caspase-12表達(dá)的調(diào)控作用，最后進(jìn)一步探討RNAi介導(dǎo)的AR抑制在HepG2細(xì)胞凋亡中的作用。 方法：

2、設(shè)計(jì)靶向人AR的siRNAs(AR siRNAs-943，AR siRNAs-2125.ARsiRNAs-2859)。以靶向SARS-CoY基因的雙鏈siRNA作為陰性對(duì)照?；瘜W(xué)合成結(jié)尾為TT的2l nt RNA，并行退火處理。用含10％胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)HepG2和7404細(xì)胞。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNAs進(jìn)入細(xì)胞。通過(guò)用胎盤藍(lán)染色計(jì)數(shù)從培養(yǎng)板中去除的細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞活力。用TRIZOL試劑抽提總RNA，并用RT-PCR檢測(cè)mRNA水平

3、。抽提總蛋白，用western blot檢測(cè)AR。構(gòu)建人PEGlO表達(dá)質(zhì)粒，并在大腸桿菌中表達(dá)。純化蛋白。制備兔源性抗PEGl0多克隆抗體。用5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。 結(jié)果：(一)3對(duì)AR siRNAs雙鏈體中，siRNAs-2859雙鏈體在mRNA和蛋白水平同時(shí)特異地抑制AR基因的表達(dá)，濃度為240nM時(shí)抑制作用最大，達(dá)80％以上。siRNAs-2859雙鏈體可特異地劑量依賴地降低7404細(xì)胞AR

4、基因的表達(dá)。濃度為240 nM AR siRNAs-2859轉(zhuǎn)染HepG2和7404細(xì)胞后，AR siRNAs-2859抑制作用可持續(xù)72h以上。AR siRNAs-2859和對(duì)照siRNAs處理培養(yǎng)液活細(xì)胞和死細(xì)胞總數(shù)無(wú)顯著差異，表明所得的AR基因表達(dá)下調(diào)不是AR siRNAs-2859雙鏈體的毒性作用所致。 (二)不同濃度的雙鏈siRNA轉(zhuǎn)染HepG2和H7404細(xì)胞，可特異地以劑量依賴的方式降低HepG2和7404細(xì)胞A

5、R表達(dá)水平。HepG2～17404細(xì)胞中，PEG 10和Caspase-12表達(dá)抑制亦存在劑量依賴性。用濃度為240nM的ARsiRNAs-2859轉(zhuǎn)染HepG2和7404細(xì)胞，24h，48h，和72h后PEG10和Caspase-12表達(dá)水平抑制作用達(dá)80％以上，且持續(xù)72h。24h后可見(jiàn)ARsiRNAs-2859介導(dǎo)的PEG10和Caspase-12表達(dá)抑制，48h后抑制作用達(dá)到最大，72h后開(kāi)始減弱。雄激素可促進(jìn)HepG2細(xì)胞PE

6、GlO和Caspase-12的表達(dá)，但對(duì)AR表達(dá)未見(jiàn)明顯作用。 (三)用不同濃度的雙鏈siRNA轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。24h后用5-Fu處理細(xì)胞，12h后AR抑制的HepG2細(xì)胞凋亡明顯增加，且與雙鏈siRNA濃度存在劑量依賴性。用濃度為240 nM的AR siRNAs-2859轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，24h后用5-Fu處理細(xì)胞，AR抑制的HepG2細(xì)胞48h內(nèi)無(wú)明顯變化。 結(jié)論：化學(xué)合成的slRNAs 能以劑量依賴地的方