AEG1促進(jìn)自噬抑制細(xì)胞失巢凋亡在肝癌中的作用研究.pdf

1、目的：肝癌是全球第五常見且未能得到有效治療的惡性腫瘤。因其早期易發(fā)生血管轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者預(yù)后。腫瘤細(xì)胞脫離原癌巢、滲入血管、發(fā)生轉(zhuǎn)移的過程，稱為“失巢”；而細(xì)胞失巢后，因其脫離細(xì)胞間及基質(zhì)的接觸支持而發(fā)生程序性死亡，即“失巢凋亡”。不同的腫瘤細(xì)胞對失巢凋亡的抵抗能力不同，抵抗能力越強(qiáng)，侵襲轉(zhuǎn)移越強(qiáng)。近年來，AEG1被證實(shí)為對肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移有重要作用的原癌基因；而自噬是通過吞噬消化自身部分蛋白或器官來度過不利環(huán)境的一種生命活動(dòng)，那么AE

2、G1、自噬、失巢凋亡抵抗在肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中起什么作用?本課題研究AEG1能否促進(jìn)自噬，進(jìn)而增強(qiáng)肝癌細(xì)胞失巢凋亡抵抗能力，最終以促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移，并探索此過程中主要信號(hào)途徑。闡明AEG1、自噬、失巢凋亡、肝癌轉(zhuǎn)移間的關(guān)系和主要機(jī)制，為尋找干預(yù)肝癌轉(zhuǎn)移靶點(diǎn)打下基礎(chǔ)。
　　方法：建立肝癌細(xì)胞體外失巢模型，利用質(zhì)粒和小干擾RNA，分別在肝癌細(xì)胞系SMMC-7721和HCC-LM3中上調(diào)和下調(diào)AGE1的表達(dá)，在模擬失巢條件下，Western bl

3、ot和流式細(xì)胞學(xué)檢測上調(diào)和下調(diào)AEG1表達(dá)后細(xì)胞凋亡率的改變；同時(shí)Western blot、GFP-RFP雙熒光系統(tǒng)檢測自噬水平。在上調(diào)AEG1的同時(shí)利用siRNA抑制自噬，在模擬失巢的情況下，Western blot檢測自噬水平降低程度和凋亡情況，同時(shí)流式細(xì)胞學(xué)檢測凋亡率。最后探討模擬失巢情況下，通過Western blot檢測AEG1調(diào)節(jié)自噬促進(jìn)失巢凋亡抵抗的主要信號(hào)通路。
　　結(jié)果：肝癌細(xì)胞株SMMC-7721過表達(dá)AEG1

4、后模擬失巢培養(yǎng)24小時(shí)，凋亡率明顯低于對照組（P<0.05）；HCC-LM3細(xì)胞中干擾AEG1的表達(dá)，模擬失巢培養(yǎng)24小時(shí)后，凋亡率明顯高于對照組（P<0.05）。SMMC-7721細(xì)胞過表達(dá)AEG1后模擬失巢培養(yǎng)，自噬GFP-RFP雙熒光系統(tǒng)檢測，以及WB顯示自噬蛋白LC3 Ⅰ型向Ⅱ型轉(zhuǎn)變增加，Ⅱ/Ⅰ型比值增大，說明自噬流增強(qiáng)；HCC-LM3細(xì)胞干擾AEG1表達(dá)后模擬失巢培養(yǎng)24小時(shí)，自噬GFP-RFP雙熒光系統(tǒng)檢測，以及WB顯示LC

5、3 Ⅰ型向Ⅱ型轉(zhuǎn)變減少，Ⅱ/Ⅰ型比值降低，自噬流減弱。干擾自噬基因，SMMC-7721、HCC-LM3模擬失巢培養(yǎng)24小時(shí)后，凋亡率明顯高于對照組（P<0.05）；過表達(dá)AEG1的SMMC-7721細(xì)胞中干擾自噬基因，模擬失巢培養(yǎng)24小時(shí)，凋亡率明顯高于對照組（P<0.05）。過表達(dá)/干擾AEG1的肝癌細(xì)胞模擬失巢培養(yǎng)24小時(shí)后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)通路被激活。
　　結(jié)論：AEG1、自噬都可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞失巢凋亡抵抗能力，并且AEG1可以