AC1MMYR2抑制癌相關(guān)成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移和化療耐藥的研究.pdf

1、目的：
　　乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的主要原因。乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛力密切依賴于腫瘤微環(huán)境，腫瘤微環(huán)境是由癌細(xì)胞、免疫細(xì)胞、癌相關(guān)成纖維細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)等組成。其中癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)是腫瘤微環(huán)境中的組成成分之一，在促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)化療耐藥中發(fā)揮重要作用。此外，我們實(shí)驗(yàn)室之前的研究結(jié)果表明，miR-21在 CAFs中過量表達(dá)，揭示miR-21異常表達(dá)可能與CAFs的形成與功能發(fā)揮密切相關(guān)。本論文主

2、要探討miR-21及miR-21小分子抑制劑——AC1MMYR2（AMR）在CAFs誘導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移和紫杉醇化療耐藥過程中的作用及分子機(jī)制。
　　方法：
　　1、利用原位雜交和免疫組化檢測60對浸潤性乳腺原位癌及轉(zhuǎn)移癌中miR-21，F(xiàn)AP-α和α-SMA的表達(dá)水平，研究此三種蛋白的表達(dá)量和腫瘤轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性。
　　2、以乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和MCF-7為模型，在以下幾種條件下培養(yǎng)：標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基培養(yǎng)、CAFs

3、條件培養(yǎng)基（CAF-CM）、加入AMR處理CAFs細(xì)胞24h后的條件培養(yǎng)基（AMR-CAF-CM）、加入紫杉醇、同時加入AMR-CAF-CM和紫杉醇；顯微鏡明場拍照觀察細(xì)胞形態(tài)變化；Transwell和Wound Healing Assay檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力；Western Bloting或免疫熒光檢測β-catenin、Vimentin、NF-κB等蛋白表達(dá)水平；Real-time PCR檢測細(xì)胞中miR-21表達(dá)水平；免疫共沉淀

4、檢測細(xì)胞中β-catenin和NF-κB的相互作用關(guān)系；MTT法檢測細(xì)胞在藥物處理后的細(xì)胞半數(shù)致死量（IC50）。
　　3、構(gòu)建 MDA-MB-231裸鼠乳腺癌原位模型。轉(zhuǎn)染 luciferase慢病毒的MDA-MB-231和CAFs以1:3注射到裸鼠乳腺脂肪墊上，建立乳腺癌裸鼠原位模型，體內(nèi)研究AMR對CAFs誘導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移的影響。小鼠被隨機(jī)分為六組（每組8只）：PBS、taxol、CAFs、CAFs-taxol、AMR-CAF

5、s、AMR-CAFs+taxol。小動物活體成像技術(shù)檢測腫瘤大小和肺轉(zhuǎn)移的熒光信號；H&E染色鑒定是否發(fā)生肺轉(zhuǎn)移；免疫組化檢測FAP-α，α-SMA，NF-κB，β-catenin和VHL的表達(dá)情況；免疫熒光檢測冰凍切片組織中α-SMA和Cytokeratin的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　第一，主要研究了癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）對乳腺癌轉(zhuǎn)移和紫杉醇耐藥性的作用。CAFs的標(biāo)志性蛋白為FAP-α和α-SMA，本論文中針

6、對60組浸潤性乳腺原位癌及轉(zhuǎn)移癌的病人樣本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn) FAP-α、α-SMA以及 miR-21的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)。進(jìn)而為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供CAFs和正常組織的成纖維細(xì)胞（NFs），我們分離并原代培養(yǎng)CAFs和NFs，發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)的CAFs細(xì)胞中高表達(dá) FAP-α、α-SMA和間質(zhì)標(biāo)記蛋白 Vimentin，而不表達(dá)表皮標(biāo)記蛋白E-cadherin和Cytokeratin，說明本論文中原代培養(yǎng)的CAFs保留了此類細(xì)胞的特性，能夠用于

7、后續(xù)實(shí)驗(yàn)。之后，將乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231經(jīng)CAFs條件培養(yǎng)基（CAF-CM）或者NFs細(xì)胞條件培養(yǎng)基（NF-CM）培養(yǎng)，與NFs組相比，CAFs能夠使乳腺癌細(xì)胞伸出微小偽足樣胞質(zhì)突起，形態(tài)上由具有極性的上皮細(xì)胞改變?yōu)槔w維狀的間質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力顯著增強(qiáng)；同時CAF-CM培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞其上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（ Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）相關(guān)蛋白β-caten

8、in、ZEB1、ZEB2表達(dá)水平顯著升高，說明CAFs能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生 EMT，從而加速轉(zhuǎn)移。最后， MCF-7和MDA-MB-231的紫杉醇的半數(shù)最大抑制濃度（IC50）分別是0.1μM和0.4μM，經(jīng)CFA-CM處理后IC50值增加了8-10倍，說明CAFs提高了乳腺癌細(xì)胞對紫杉醇的耐受性。綜合以上結(jié)果說明，在乳腺癌病人樣本中CAFs細(xì)胞與癌癥淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)，同時在細(xì)胞水平證明了，CAFs能夠誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和對紫杉醇的

9、化療耐藥。
　　第二，主要研究 miR-21在 CAFs誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用。RT-PCR方法證明了，經(jīng)CAF-CM處理，MCF-7和MDA-MB-231的miR-21表達(dá)水平分別增加了1.8和2.4倍，證明CAFs能夠誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞表達(dá)miR-21。此外，采用轉(zhuǎn)染miR-21 mimics的NFs培養(yǎng)以上兩種乳腺癌細(xì)胞，細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)、細(xì)胞形態(tài)由上皮向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變、EMT相關(guān)β-catenin和Vimentin的表達(dá)

10、水平升高；AMR-CAF-CM處理可降低CAFs中miR-21的表達(dá)，并且能夠有效逆轉(zhuǎn)CAFs誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，減少β-catenin和Vimentin表達(dá)，達(dá)到正常成纖維細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的效果。以上結(jié)果說明，miR-21在 CAFs的高表達(dá)是其促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞EMT以及轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素。
　　第三，主要研究miR-21抑制劑——AMR對CAFs誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和紫杉醇耐受性的作用及其分子機(jī)制。AMR-CAF-CM處理

11、能夠降低 CAFs誘導(dǎo)的MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力。其次，紫杉醇能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，但是在CAF-CM處理乳腺癌細(xì)胞時，紫杉醇無法對癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲發(fā)揮促進(jìn)作用。而在AMR-CAF-CM處理乳腺癌細(xì)胞時，同時加入紫杉醇，可以下調(diào)β-catenin、ZEB1、ZEB2的表達(dá)，上調(diào) E-cadherin的表達(dá)，減少β-catenin核轉(zhuǎn)位，即抑制細(xì)胞發(fā)生EMT。以上結(jié)果說明，AMR重塑CAFs，抑制

12、CAFs誘導(dǎo)的乳腺癌轉(zhuǎn)移并提高乳腺癌細(xì)胞對紫杉醇的敏感性。
　　進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，對CAFs促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞由內(nèi)皮向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變過程的機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：AMR-CAF-CM處理MCF-7和MDA-MB-231時，能夠抑制miR-21的表達(dá)，促進(jìn)miR-21的靶基因VHL的表達(dá)，導(dǎo)致NF-κB表達(dá)降低，減少NF-κB和β-catenin的共沉淀，抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)紫杉醇的化療效果。說明AMR可以通過miR-21/VHL/NF-κ

13、B抑制CAFs誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增強(qiáng)紫杉醇化療效果。
　　第四，在小鼠體內(nèi)驗(yàn)證AMR的作用。生物發(fā)光成像顯示紫杉醇可以在一定程度上抑制腫瘤的生長，在CAFs處理組紫杉醇藥效降低，而AMR聯(lián)合紫杉醇可以顯著抑制腫瘤生長。此外，H＆E染色實(shí)驗(yàn)表明CAFs能夠促進(jìn)癌癥細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生廣泛的腫瘤灶，聯(lián)合治療組能夠抑制肺轉(zhuǎn)移。此外免疫組化實(shí)驗(yàn)表明AMR能使CAFs細(xì)胞中FAP-α，α-SMA的表達(dá)水平顯著降低，使乳腺癌細(xì)胞中VHL的表

14、達(dá)水平升高，β-catenin、NF-κB的表達(dá)水平降低。該體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果再次驗(yàn)證了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)論。
　　結(jié)論：
　　本論文證明了CAFs能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、EMT和對紫杉醇的化療耐藥，并且發(fā)現(xiàn)miR-21是維持CAFs對乳腺癌細(xì)胞作用的關(guān)鍵因素。采用miR-21的小分子抑制劑——AC1MMYR2能夠抑制CAFs對癌癥細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用并增強(qiáng)癌細(xì)胞對紫杉醇的化療敏感性，其分子機(jī)制為AC1MMYR2抑制CAF