腫瘤相關巨噬細胞CGI-58在結腸癌惡性進展中的作用研究.pdf

1、結直腸癌是一種常見的消化道惡腫瘤，其發(fā)病率在其他惡性腫瘤中排名第三[1]。像其他實體瘤一樣，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與多種炎性細胞的介導相關，其中也包括了巨噬細胞[2，3]。新近報道稱，浸潤在腫瘤組織中的巨噬細胞稱為腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)[4，5]。腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)活化介導的炎性微環(huán)境在腫瘤惡性進展過程中起重要作用。炎性因子促進腫瘤的發(fā)展在以往的研究中較多，然而新近研究表明間質(zhì)細胞的代謝重編程在調(diào)節(jié)腫瘤生物學中起著至關重要的作用

2、[6-8]。CGI-58，又名ABHD5，是一種新發(fā)現(xiàn)的促進脂肪分解的輔酶，廣泛表達于人體各個組織器官中。我們在免疫組化和巨噬細胞-結腸癌細胞共培養(yǎng)體系的實驗中發(fā)現(xiàn)，CGI-58的表達在腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)中是明顯升高的。我們運用本實驗室巨噬細胞-結腸癌細胞共培養(yǎng)體系，特異性敲低巨噬細胞CGI-58和過表達巨噬細胞CGI-58，并運用體內(nèi)和體外實驗證明了巨噬細胞CGI-58在結腸癌細胞增殖、凋亡和侵襲能力的影響，揭示了巨噬細胞C

3、GI-58對結腸癌惡性進展的影響。同時我們進一步用Western blot和Real-time PCR法來探討其可能的機制，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞在CGI-58缺失的情況下，可抑制FOXO1的磷酸化，進而增強其轉錄活性，促進IL-1β的表達。我們的研究以腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)脂質(zhì)代謝異常為切入點，率先解析腫瘤相關巨噬細胞(TAMs) CGI-58在慢性炎癥和結腸癌惡性進展的中的作用，研究結果對于從腫瘤微環(huán)境角度尋找結腸癌的有效防治策略有重要

4、指導意義。
　　目的:
　　研究腫瘤相關巨噬細胞在CGI-58在結腸癌惡性進展中所起的作用。
　　方法:
　　1.CGI-58在腫瘤相關巨噬細胞中的表達
　　為了研究結腸癌中的脂代謝重編程與腫瘤相關巨噬細胞的關系，我們運用免疫組化的方法來檢測人類結腸癌及癌旁組織和小鼠結腸癌及癌旁組織，并根據(jù)Remmele和stegner提出的免疫反應評分（Immunoreactive Score簡稱IRS）來評價免疫組化染

5、色的情況，觀察CGI-58在腫瘤相關巨噬細胞的表達情況。在細胞水平上，我們運用小鼠結腸癌細胞系CT26和MC38的條件上清液來處理巨噬細胞RAW2647，并用正常培養(yǎng)基處理的RAW2647來做對照，用western blot和Realtime PCR法來檢測不同處理條件下CGI-58的表達情況。
　　2.腫瘤相關巨噬細胞CGI-58促進結腸癌細胞的惡性進展
　　為了進一步研究腫瘤相關巨噬細胞CGI-58在結腸癌進展中的作用，

6、我們采用慢病毒介導的基因穩(wěn)定敲低或升高RAW264.7中的CGI-58表達，Western blot分析實驗結果及使用藥物進行穩(wěn)定轉染細胞株的篩選，以獲得穩(wěn)定的細胞克隆株。
　　在體外實驗中，分別用收取巨噬細胞條件培養(yǎng)基、巨噬細胞CGI-58敲低組條件培養(yǎng)基和巨噬細胞CGI-58過表達組條件培養(yǎng)基來處理小鼠結腸癌細胞CT26，并分別運用CCK-8、細胞周期、細胞凋亡AnnexinⅤ FITC、克隆形成實驗來檢測腫瘤相關巨噬細胞CG

7、I-58是否影響結腸癌的進展。
　　體內(nèi)實驗中，我們將BABL/C小鼠用CT26細胞系接種上皮下瘤，并分別用巨噬細胞條件培養(yǎng)基和巨噬細胞CGI-58敲低組條件培養(yǎng)基、巨噬細胞條件培養(yǎng)基和巨噬細胞條件培養(yǎng)基巨噬細胞CGI-58高表達組條件培養(yǎng)基來皮下注射瘤周，并觀察腫瘤的大小。
　　3.巨噬細胞CGI-58促進結腸癌細胞惡性增殖的機制初探。
　　我們將巨噬細胞CGI-58高表達組、巨噬細胞CGI-58缺失組、正常巨噬細胞

8、組及加入FOXO1的抑制AS1842856劑處理的巨噬細胞組，利用western blot和RealtimePCR法來檢測巨噬細胞CGI-58對IL-1β和FOXO1的表達調(diào)控。
　　結論:
　　1.在免疫組化實驗中，CGI-58的表達量在腫瘤相關巨噬細胞ATMs中明顯地高于癌旁巨噬細胞。用小鼠結腸癌細胞系CT26、MC38條件培養(yǎng)基處理的巨噬細胞與正常培養(yǎng)基處理的巨噬細胞比較，其CGI-58的表達水平更高。我們得出結論CG

9、I-58的表達在腫瘤相關巨噬細胞TAMs中升高的，CGI-58可能在脂質(zhì)聚集較多的TAMs起到了分解作用。
　　2.巨噬細胞CGI-58敲低條件培養(yǎng)基處理小鼠結腸癌細胞CT26，較巨噬細胞條件培養(yǎng)基，其腫瘤細胞增殖明顯降低、細胞周期的G1期增加、克隆形成率較低，而巨噬細胞CGI-58高表達組結果相反。在皮下瘤瘤模型中，我們統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)用巨噬細胞CGI-58敲低組條件培養(yǎng)基處理的皮下瘤體積較對照巨噬細胞條件培養(yǎng)基處理組小，小鼠的存活率更

10、高。我們可以得出結論，腫瘤相關巨噬細胞CGI-58缺失的情況下可以抑制結腸癌的惡性進展。
　　3.巨噬細胞CGI-58敲低組較之對照組，IL-1β表達明顯上調(diào)，F(xiàn)OXO1的磷酸化水平降低，提示FOXO1轉錄激活;而先前研究表明，F(xiàn)OXO1可調(diào)控IL-1β的轉錄表達，因此我們推測CGI-58缺失可能通過激活FOXO1蛋白轉錄活性而促進IL-1β的mRNA水平。而在腫瘤相關巨噬細胞中，CGI-58表達升高，我們猜測:CGI-58/FO