hMLH1基因啟動子甲基化與非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥及預(yù)后關(guān)系的研究.pdf

1、肺癌是當(dāng)今發(fā)病率和腫瘤相關(guān)死亡最高的惡性腫瘤，其中80％～85％為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療是NSCLC的標(biāo)準(zhǔn)化療方案，對鉑類藥物的耐受是導(dǎo)致化療失敗，腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要原因，也是NSCLC治療中亟待解決的難題。隨著表遺傳學(xué)研究的深入，最近有研究顯示，hMLH1啟動子甲基化可能介導(dǎo)了卵巢癌和結(jié)直腸癌的順鉑耐藥，去甲基化干預(yù)可以部分逆轉(zhuǎn)腫瘤的順鉑耐藥。那么hM

2、LH1啟動子甲基化是否也導(dǎo)致了NSCLC的順鉑耐藥，是否能作為NSCLC耐藥逆轉(zhuǎn)的靶點，目前國內(nèi)外尚無系統(tǒng)研究。本研究細(xì)胞試驗部分通過檢測NSCLC順鉑敏感細(xì)胞株A549和耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP的hMLH1啟動子甲基化狀態(tài)，探討hMLH1啟動子甲基化是否與NSCLC的順鉑耐藥有關(guān)，并觀察去甲基化藥物(5-Aza-dc)能否去除該基因啟動子甲基化，逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥。在臨床試驗部分，檢測了83例NSCLC患者h(yuǎn)MLH1啟動子甲基化狀態(tài)，結(jié)

3、合患者的臨床病理和隨訪資料，以探討hMLH1啟動子甲基化是否與NSCLC臨床特征相關(guān)，是否能作為一項有效的分子標(biāo)志用于預(yù)測術(shù)后順鉑輔助化療后患者的生存和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。 第一章 hMLH1基因啟動子甲基化與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞順鉑耐藥的相關(guān)研究 目的：探討hMLH1基因啟動子甲基化是否與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549/DDP順鉑耐藥相關(guān)；去甲基化藥物5-Aza-dc對A549/DDP細(xì)胞hMLH1基因啟動子甲基化狀態(tài)、基因表達(dá)和順鉑耐受

4、性的影響。 方法：MSP法檢測非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥細(xì)胞株A549/DDP和其親本株A549的hMLH1啟動子甲基化狀態(tài)；MTT法和流式細(xì)胞術(shù)測定A549/DDP對順鉑的耐藥指數(shù)、5-Aza-dc對A549/DDP細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用和不同濃度5-Aza-dc處理48小時后A549/DDP細(xì)胞對順鉑的IC50和耐藥逆轉(zhuǎn)指數(shù)；MSP法、熒光定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)和Western blot檢測5-Aza-d

5、c對A549/DDP細(xì)胞hMLH1基因啟動子甲基化狀態(tài)、mRNA和蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果：A549和A549/DDP細(xì)胞對順鉑的IC50分別為5.20±0.14μM和30.15±0.76μM，A549/DDP的耐藥指數(shù)為5.80，確定為耐順鉑的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株；MSP檢測A549為hMLH1基因啟動子非甲基化細(xì)胞株，A549/DDP為hMLH1基因啟動子部分甲基化細(xì)胞株；MTT及流式細(xì)胞術(shù)檢測作用48小時時，20gM5-Aza

6、-dc為對A549/DDP細(xì)胞的無毒劑量，40μM為低毒劑量；以無毒和低毒劑量5-Aza-dc(20μM、40μM)處理A549/DDP后，順鉑對A549/DDP細(xì)胞的IC50分別降低到16.54±0.35μM和6.82±0.16μM；耐藥逆轉(zhuǎn)指數(shù)分別為1.82和4.42；MSP、Real-time RT-PCR及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)無毒和低毒劑量5-Aza-dc均能很好地去除hMLH1啟動子甲基化，hMLH1mRNA和蛋白

7、表達(dá)增高。 結(jié)論：hMLH1基因啟動子甲基化可能參與了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549/DDP的順鉑耐藥；小劑量5-Aza-dc對A549/DDP細(xì)胞無明顯的增殖抑制和促凋亡作用，但可能通過去除hMLH1啟動子甲基化，上調(diào)hMLH1基因表達(dá)而部分逆轉(zhuǎn)A549/DDP對順鉑的化療耐藥。 第二章 hMLH1基因啟動子甲基化在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)和臨床意義 目的：檢測手術(shù)切除并接受順鉑為基礎(chǔ)輔助化療后的非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織

8、中hMLH1基因啟動子甲基化狀態(tài)，探討hMLH1基因啟動子甲基化與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。 方法：采用改良的酚/氯仿手工法提取83例接受順鉑為基礎(chǔ)輔助化療的NSCLC患者的福爾馬林固定.石蠟包埋(Formalin-fixed andParrffin-Embedded，F(xiàn)FPE)腫瘤組織DNA；巢式MSP(nested-MSP)法檢測hMLH1基因啟動子甲基化狀態(tài)；結(jié)合臨床病理及隨訪資料，X2檢驗分析hMLH1基因啟動子甲基

9、化與其臨床病理特征的關(guān)系；單因素Kaplan-Meier法(Log-rank檢驗)和多因素Cox回歸對其啟動子甲基化與患者總體生存進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析；多因素Logistic回歸對其啟動子甲基化與患者無病生存進(jìn)行分析。 結(jié)果：83例NSCLC腫瘤樣本中80例成功進(jìn)行了巢式MSP擴(kuò)增，其中33例發(fā)生hMLH1基因啟動子甲基化(41.25％)。hMLH1啟動子甲基化與患者年齡、性別、吸煙狀態(tài)、腫瘤T分期、病理類型、分化程度、三年總體生存無

10、關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期(N)、三年無病生存相關(guān)?？傮w生存的單因素分析和多因素Cox分析均顯示僅腫瘤N分期與總體生存有關(guān)，hMLH1啟動子甲基化狀態(tài)與總體生存無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)，腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的多因素Logistic分析結(jié)果顯示hMLH1啟動子甲基化狀態(tài)和腫瘤N分期與患者無病生存相關(guān)，甲基化陽性的患者更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和術(shù)后順鉑輔助化療后的腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。 結(jié)論：hMLH1啟動子甲基化是NSCLC的普遍事件，與NSCLC患者的N分期和無