hMLH1基因啟動子甲基化與非小細胞肺癌順鉑耐藥及預后關系的研究.pdf

1、肺癌是當今發(fā)病率和腫瘤相關死亡最高的惡性腫瘤，其中80％～85％為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。以鉑類為基礎的聯(lián)合化療是NSCLC的標準化療方案，對鉑類藥物的耐受是導致化療失敗，腫瘤復發(fā)和轉移的主要原因，也是NSCLC治療中亟待解決的難題。隨著表遺傳學研究的深入，最近有研究顯示，hMLH1啟動子甲基化可能介導了卵巢癌和結直腸癌的順鉑耐藥，去甲基化干預可以部分逆轉腫瘤的順鉑耐藥。那么hM

2、LH1啟動子甲基化是否也導致了NSCLC的順鉑耐藥，是否能作為NSCLC耐藥逆轉的靶點，目前國內外尚無系統(tǒng)研究。本研究細胞試驗部分通過檢測NSCLC順鉑敏感細胞株A549和耐順鉑細胞株A549/DDP的hMLH1啟動子甲基化狀態(tài)，探討hMLH1啟動子甲基化是否與NSCLC的順鉑耐藥有關，并觀察去甲基化藥物(5-Aza-dc)能否去除該基因啟動子甲基化，逆轉腫瘤耐藥。在臨床試驗部分，檢測了83例NSCLC患者hMLH1啟動子甲基化狀態(tài)，結

3、合患者的臨床病理和隨訪資料，以探討hMLH1啟動子甲基化是否與NSCLC臨床特征相關，是否能作為一項有效的分子標志用于預測術后順鉑輔助化療后患者的生存和復發(fā)轉移。 第一章 hMLH1基因啟動子甲基化與非小細胞肺癌細胞順鉑耐藥的相關研究 目的：探討hMLH1基因啟動子甲基化是否與非小細胞肺癌細胞A549/DDP順鉑耐藥相關；去甲基化藥物5-Aza-dc對A549/DDP細胞hMLH1基因啟動子甲基化狀態(tài)、基因表達和順鉑耐受

4、性的影響。 方法：MSP法檢測非小細胞肺癌順鉑耐藥細胞株A549/DDP和其親本株A549的hMLH1啟動子甲基化狀態(tài)；MTT法和流式細胞術測定A549/DDP對順鉑的耐藥指數(shù)、5-Aza-dc對A549/DDP細胞的細胞毒性作用和不同濃度5-Aza-dc處理48小時后A549/DDP細胞對順鉑的IC50和耐藥逆轉指數(shù)；MSP法、熒光定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)和Western blot檢測5-Aza-d

5、c對A549/DDP細胞hMLH1基因啟動子甲基化狀態(tài)、mRNA和蛋白表達的影響。 結果：A549和A549/DDP細胞對順鉑的IC50分別為5.20±0.14μM和30.15±0.76μM，A549/DDP的耐藥指數(shù)為5.80，確定為耐順鉑的非小細胞肺癌細胞株；MSP檢測A549為hMLH1基因啟動子非甲基化細胞株，A549/DDP為hMLH1基因啟動子部分甲基化細胞株；MTT及流式細胞術檢測作用48小時時，20gM5-Aza

6、-dc為對A549/DDP細胞的無毒劑量，40μM為低毒劑量；以無毒和低毒劑量5-Aza-dc(20μM、40μM)處理A549/DDP后，順鉑對A549/DDP細胞的IC50分別降低到16.54±0.35μM和6.82±0.16μM；耐藥逆轉指數(shù)分別為1.82和4.42；MSP、Real-time RT-PCR及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)無毒和低毒劑量5-Aza-dc均能很好地去除hMLH1啟動子甲基化，hMLH1mRNA和蛋白

7、表達增高。 結論：hMLH1基因啟動子甲基化可能參與了非小細胞肺癌細胞A549/DDP的順鉑耐藥；小劑量5-Aza-dc對A549/DDP細胞無明顯的增殖抑制和促凋亡作用，但可能通過去除hMLH1啟動子甲基化，上調hMLH1基因表達而部分逆轉A549/DDP對順鉑的化療耐藥。 第二章 hMLH1基因啟動子甲基化在非小細胞肺癌中的表達和臨床意義 目的：檢測手術切除并接受順鉑為基礎輔助化療后的非小細胞肺癌患者腫瘤組織

8、中hMLH1基因啟動子甲基化狀態(tài)，探討hMLH1基因啟動子甲基化與患者臨床病理特征及預后的關系。 方法：采用改良的酚/氯仿手工法提取83例接受順鉑為基礎輔助化療的NSCLC患者的福爾馬林固定.石蠟包埋(Formalin-fixed andParrffin-Embedded，F(xiàn)FPE)腫瘤組織DNA；巢式MSP(nested-MSP)法檢測hMLH1基因啟動子甲基化狀態(tài)；結合臨床病理及隨訪資料，X2檢驗分析hMLH1基因啟動子甲基

9、化與其臨床病理特征的關系；單因素Kaplan-Meier法(Log-rank檢驗)和多因素Cox回歸對其啟動子甲基化與患者總體生存進行統(tǒng)計學分析；多因素Logistic回歸對其啟動子甲基化與患者無病生存進行分析。 結果：83例NSCLC腫瘤樣本中80例成功進行了巢式MSP擴增，其中33例發(fā)生hMLH1基因啟動子甲基化(41.25％)。hMLH1啟動子甲基化與患者年齡、性別、吸煙狀態(tài)、腫瘤T分期、病理類型、分化程度、三年總體生存無

10、關，與淋巴結轉移分期(N)、三年無病生存相關。總體生存的單因素分析和多因素Cox分析均顯示僅腫瘤N分期與總體生存有關，hMLH1啟動子甲基化狀態(tài)與總體生存無統(tǒng)計學相關，腫瘤復發(fā)和轉移的多因素Logistic分析結果顯示hMLH1啟動子甲基化狀態(tài)和腫瘤N分期與患者無病生存相關，甲基化陽性的患者更容易發(fā)生淋巴結轉移和術后順鉑輔助化療后的腫瘤復發(fā)和轉移。 結論：hMLH1啟動子甲基化是NSCLC的普遍事件，與NSCLC患者的N分期和無