胃癌hMLH1和RASSF1A基因異常甲基化的研究.pdf

1、胃癌是全世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在我國(guó)居各類(lèi)惡性腫瘤之首。近年來(lái)的研究表明，胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因參與的多階段過(guò)程。 腫瘤抑制基因(Tumor Suppressor Gene，TSG)是生物體內(nèi)細(xì)胞增殖、分化和凋亡過(guò)程中的負(fù)性調(diào)節(jié)信號(hào)之一。細(xì)胞周期調(diào)控體系對(duì)維持正常細(xì)胞周期是必需的，而調(diào)控體系中關(guān)鍵因子的異常可導(dǎo)致調(diào)控紊亂，以致細(xì)胞增殖異常，不能及時(shí)分化和凋亡、腫瘤發(fā)生。 目前認(rèn)為DNA異常甲基化改變是除缺失與突變

2、之外導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)失活的第三種機(jī)制，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著不可忽視的作用。DNA甲基化(methy-lation)是DNA的一種天然修飾方式，是由DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltrans-ferase,DNMT)催化的加上甲基基團(tuán)(CH<,3>-)的堿基修飾過(guò)程。基因甲基化的過(guò)程就是基因表達(dá)受到抑制的過(guò)程。抑癌基因甲基化以及基因啟動(dòng)子甲基化都與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。 HMLH1和Rassfla基因是與腫瘤發(fā)生有密切關(guān)系

3、的抑癌基因。其甲基化失活將有助于細(xì)胞的無(wú)限制生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤的形成。對(duì)這方面進(jìn)行研究有助于揭示細(xì)胞周期的調(diào)控，并為闡明細(xì)胞增殖、分化、癌變等過(guò)程提供線(xiàn)索，并且可能為腫瘤的臨床診斷、治療、預(yù)后提供理論、實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 本實(shí)驗(yàn)采用甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR，MSP)方法檢測(cè)癌旁5、3、1厘米組織及胃癌原發(fā)灶中hMLH1和RASSF1A基因甲基化水平表達(dá)情況。旨在探討：hMLH1和RASSF1A基因

4、甲基化由胃癌旁不同距離至癌原發(fā)灶的動(dòng)態(tài)變化；兩種基因甲基化在正常組織、癌前病變及癌灶中表達(dá)的變化；兩基因甲基化與胃癌原發(fā)灶病理生物學(xué)行為的關(guān)系。 實(shí)驗(yàn)方法: 研究對(duì)象為2006年1月～2006年8月在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腫瘤外科手術(shù)胃癌患者40例。本實(shí)驗(yàn)共選取手術(shù)切除后距胃癌原發(fā)灶5、3、1厘米的組織塊及胃癌原發(fā)灶組織塊共160枚。所取標(biāo)本均分為2份，一份即放入-70℃冰箱保存，一份用甲醛固定、石蠟包埋后保存。其中男性30例，女

5、性10例，男女比例為3：1，最大年齡為78歲，最小年齡為29歲，平均年齡61.5±11.65歲。全部病例按UICC新TNM分期標(biāo)準(zhǔn)、日本胃癌處理規(guī)約及中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所胃癌外科分型進(jìn)行分期分型，以上病例均經(jīng)病理診斷證實(shí)，所有患者術(shù)前均未經(jīng)術(shù)前放療、化療等。采用MSP法進(jìn)行HMLH1和Rassfla基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，各組間率的比較采用x<'2>檢驗(yàn)、Fisher’s精確概率法

6、檢驗(yàn)，檢驗(yàn)顯著性水準(zhǔn)取a=0.05，P<0.05有顯著性意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.40例胃癌病例：胃癌旁5cm組織中hMLH1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性率為2.5％(1/40)；胃癌旁3cm組織中hMLHl基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性率為12.5％(5/40)；胃癌旁1cm組織中hMLH1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性率為10％(4/40)；胃癌組織中hMLHl基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性率為32.5％(13/40)。胃癌灶旁5、3、1厘米組織甲

7、基化陽(yáng)性率均明顯低于胃癌原發(fā)灶，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。從胃癌癌旁5厘米組織至癌原發(fā)灶，隨距癌灶距離減少，hMLH1基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率隨之上升，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 2.40例胃癌病例：胃癌旁5cm組織中RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性率為5％(2/40)；癌旁3cm組織中RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性率為7.5％(3/40)；癌旁1cm組織中RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性率為

8、22.5％(9/40)；胃癌組織中RASSFlA基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性率為42.5％(17/40)。胃癌灶旁5、3厘米R(shí)ASSFlA基因啟動(dòng)子區(qū)組織甲基化陽(yáng)性率均明顯低于胃癌原發(fā)灶，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。從胃癌癌旁5厘米組織至胃癌原發(fā)灶，隨距癌灶距離減少，RASSFlA基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性率隨之上升，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 3.胃癌癌旁5cm正常組織、癌旁癌前病變組織及胃癌原發(fā)灶中hMLH1基因甲

9、基化陽(yáng)性率分別為0％(0/24)、8.69％(2/23)、32.5％(13/40)。癌旁5cm正常組織hMLH1基因甲基化陽(yáng)性率低于有癌前病變的組織，二者均明顯低于胃癌原發(fā)灶，三者間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01) 。 4.胃癌癌旁5cm正常組織、癌旁癌前病變組織及胃癌原發(fā)灶中RASSF1A基因甲基化陽(yáng)性率分別為O％(0/24)、17.39％(4/23)、42.5％(17/40)。癌旁5cm正常組織RASSF1A基因甲基化陽(yáng)性

10、率低于有癌前病變的組織，二者均明顯低于胃癌原發(fā)灶，三者間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 5.40例胃癌患者按照轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)分為0.7枚組與7枚以上二組，轉(zhuǎn)移達(dá)7枚以上組hMLH1、RASSF1A基因甲基化陽(yáng)性率明顯高于轉(zhuǎn)移7枚以下組，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 6.40例胃癌患者按照浸潤(rùn)深度分為未透漿膜與透漿膜二組，透漿膜組hMLH1、RASSFlA基因甲基化陽(yáng)性率明顯高于未透漿膜，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)

11、意義(P<0.05)。 7.40例胃癌患者按照大體類(lèi)型、生長(zhǎng)方式、分化程度、性別、年齡分組，hMLH1、RASSF1A基因甲基化陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論: 1.胃癌原發(fā)灶中hMLH1、RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽(yáng)性率明顯升高，hMLH1、RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化可能是胃癌癌變過(guò)程中的重要分子事件。 2.hMLH1基因、RASSF1A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化在胃癌癌旁5cm正常