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文檔簡介
1、甲基化是研究最為深入的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。該機(jī)制的異化可導(dǎo)致基因表達(dá)的異常及基因組穩(wěn)定性的降低,繼而促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展。啟動子CpG島的高甲基化已被認(rèn)為是與遺傳性缺陷同等重要的、造成抑癌基因在腫瘤中失活的分子生物學(xué)機(jī)制。我們早期的實驗使用甲基特異性PCR(methylation specific PCR,MSP)檢測膀胱腫瘤RASSF1A基因甲基化,雖然表明兩者存在一定關(guān)聯(lián),但臨床診斷意義不高。 本研究擬從以下兩個方面探索提高膀胱腫
2、瘤標(biāo)本RASSFlA基因甲基化臨床診斷意義的途徑。 一,改變退火溫度對甲基特異性PCR檢驗指標(biāo)有效性的影響。 目的:探討改變退火溫度對甲基特異性PCR檢驗指標(biāo)有效性及診斷意義的影響。 方法:將經(jīng)測序證實的RASSF1A完全甲基化標(biāo)本作為100%M標(biāo)本,完全未甲基化標(biāo)本作為0%M標(biāo)本,按1:3體積比例混合,作梯度PCR擴(kuò)增,摸索適當(dāng)?shù)耐嘶饻囟?。選取單一電泳條帶的溫度為優(yōu)化的退火溫度,并以這些溫度檢測70例標(biāo)本(35
3、對,以同一病人的腫瘤組織K、癌旁組織N為一對),比較其在各溫度情況時的擴(kuò)增效果。 結(jié)果:70歲以下組60.7℃陰性似然比0、陰性預(yù)測值1.00、診斷靈敏度1.00、ROE曲線面積值0.750;而文獻(xiàn)使用溫度64.0℃陰性似然比0.8、陰性預(yù)測值0.56、診斷靈敏度0.33、ROC曲線面積值0.583:70歲以上組60.7℃陰性似然比0.67、陰性預(yù)測值0.60、ROC曲線面積值0.529。其余各指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)論:
4、應(yīng)用MSP檢測RASSF1A甲基化可以作為膀胱腫瘤早期診斷的輔助方法,較低年齡組的應(yīng)用價值大于高年齡組,尤其是在排除腫瘤方面。臨床腫瘤標(biāo)本具有相當(dāng)?shù)膹?fù)雜性,使用各種方法檢測臨床標(biāo)本要充分考慮到各種生物學(xué)因素(如:年齡等)的影響。在應(yīng)用MSP檢測臨床腫瘤標(biāo)本時,可根據(jù)不同年齡段調(diào)整退火溫度,以提高檢驗指標(biāo)的有效性及診斷價值。 二,應(yīng)用McMSP分析RASSF1A啟動子區(qū)域甲基化。 目的:應(yīng)用McMSP分析RASSF1A啟動
5、子區(qū)域甲基化狀況,探索McMSP定量檢測甲基化的可行性、靈敏度、診斷價值,并簡化操作流程,降低成本。 方法:先對已行常規(guī)甲基特異性PCR(MSP)擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析(Melting Curve Anlysis,MCA);然后將熒光素SYBR Green Ⅰ直接加入PCR反應(yīng)前體系進(jìn)行擴(kuò)增(即McMSP);探索McMSP分析的靈敏度:將標(biāo)本按1:10,1:100,1:500,1:1000,1:5000,1:10000稀釋
6、后,分別行MSP和McMSP。 結(jié)果:(1)沒有應(yīng)用商業(yè)試劑盒,同時將文獻(xiàn)報道的SYBR Green Ⅰ濃度降低至10000x,仍能獲得滿意的結(jié)果;(2)常規(guī)MSP標(biāo)本1:100稀釋(DNA量>100pg)時就已檢測不到目的產(chǎn)物,而該法在DNA 1:10000稀釋后(DNA量<2pg),仍可以檢測到所需要的目的產(chǎn)物;(3)McMSPROC曲線分析,70歲以下組、70歲以上組及所有標(biāo)本Tm cut-off值分別為62.525、63
7、.535、62.935;ROC面積值分別為0.846、0.750、0.819。 結(jié)論:利用實時熒光定量PCR熔解曲線分析法檢測RASSF1A啟動子區(qū)域甲基化迅速準(zhǔn)確,操作簡便,成本低廉,結(jié)果直觀,并具有較常規(guī)MSP更高的靈敏度和診斷價值。 三,本實驗還檢測了膀胱腫瘤RASSF1A家族基因RASSF2A、NORE1A甲基化狀況及RASSF1A的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。 目的:在已完成膀胱腫瘤RASSF1A基因甲基化檢測的基
8、礎(chǔ)上,對RASSF基因家族的甲基化狀況做初步篩查,并在蛋白質(zhì)層面探討RASSF1A DNA甲基化與基因表達(dá)的關(guān)系。 方法:采用MSP技術(shù)檢測54例膀胱癌組織及其相應(yīng)癌周正常組織RASSF2A、NORE1A基因啟動子甲基化狀態(tài);用免疫組織化學(xué)方法檢測18例膀胱正常組織及38例膀胱移行上皮癌(TCC)組織中RASSF1A基因的表達(dá)情況,并與臨床特征相比較。 結(jié)果:(1)RASSF2A檢出率僅為2/54,NORE1A僅為0/5
9、4;(2)相應(yīng)癌周正常組織和3例正常膀胱組織均未發(fā)現(xiàn)該基因高甲基化改變;(3)甲基化狀態(tài)與膀胱癌臨床病理參數(shù)無明顯相關(guān)性; (4)RASSF1A在膀胱TCC和正常組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)陽性率分別為39%和83%;將免疫組化結(jié)果判讀為(-)者與對應(yīng)DNA甲基化、mRNA表達(dá)兩個指標(biāo)對照,相應(yīng)標(biāo)本分別有83.3%(20/24)存在DNA甲基化,79.2%(19/24)存在mRNA表達(dá)下調(diào)。 結(jié)論:在膀胱癌中,RASSF2A、NORE1A
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