青年食管和賁門癌RASSF1A甲基化及蛋白表達.pdf

1、中國北方太行山區(qū)是食管鱗癌(Esophageal squamous cell carcinoma.SCC)和賁門腺癌(Gastric cardia adenocarcinoma，GCA)同時高發(fā)的地區(qū)。SCC和GCA好發(fā)年齡段均為50歲以上的中老年人。近年的研究提示，中國北方SCC高發(fā)區(qū)青年(=40歲)食管鱗癌和賁門腺癌并不罕見。某些學者認為：與中老年SCC患者相比，青年SCC患者癌細胞分化差，易發(fā)生浸潤性生長和早期血管轉(zhuǎn)移，5年生存率

2、更低，預(yù)后極差。提示青年SCC和GCA可能有其獨特的分子基礎(chǔ)。青年患者的存在引發(fā)一個重要的學術(shù)問題：為什么在相同的生活環(huán)境中，青年患者可提前10余年發(fā)病?我們的假設(shè)是：個體的遺傳易感因素可能在青年SCC和GCA發(fā)病中起更重要的作用。河南SCC和GCA高發(fā)區(qū)存在明顯的SCC和GCA家族聚集現(xiàn)象，進一步提示遺傳因素在SCC和GCA癌變中可能起重要作用。但SCC和GCA遺傳易感性的分子機制尚不十分清楚。近年研究提示，RASSFlA(Ras相關(guān)

3、區(qū)域家族1A，Ras-association domain familylA)基因是2000年克隆得到的新的腫瘤抑制基因，位于染色體3p21.3區(qū)。它所表達的產(chǎn)物廣泛存在于肺、肝臟、消化道等多種器官和組織中，在調(diào)控細胞的增殖和凋亡中具有重要作用，體內(nèi)外均能抑制腫瘤的生長。RASSF1A啟動子甲基化是其失活的主要機制。但是，目前尚未見到RASSF1A基因與中國北方太行山高發(fā)區(qū)青年SCC和GCA癌變關(guān)系的報道。本研究對中國北方太行山高發(fā)區(qū)S

4、CC和GCA高發(fā)區(qū)14814例SCC患者和7457例GCA患者進行回顧性調(diào)查，了解SCC和GCA高發(fā)區(qū)青年SCC和GCA的檢出率及臨床病理特點；檢測部分青年SCC和GCA組織中RASSFlA啟動子甲基化及蛋白表達，探討其在SCC和GCA癌變中的作用，以加深對青年SCC和GCA遺傳易感性的認識。 2．材料與方法2．1材料來源所有臨床病理資料均來自1974年-2006年山西省磁縣人民醫(yī)院和姚村食管癌醫(yī)院以及1998年-2006年林州中心醫(yī)院

5、14814例SCC和7457例GCA的臨床和病理記錄，根據(jù)病理診斷報告和住院記錄分別統(tǒng)計SCC患者人數(shù)、性別、年齡、病理特征等，并對這些數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。 SCC和GCA組織標本均來自林州地區(qū)患者手術(shù)切除標本。SCC共40例，其中青年組患者13例，平均年齡39±1歲；老年組患者27例，平均年齡72±2歲。GCA共24例，其中青年組患者10例，平均年齡37±2歲；老年組患者14例，平均年齡68±3歲。食管和賁門正常組織均取自同一個

6、體癌旁正常組織(組織病理學證實)。所有患者術(shù)前均未接受任何放療或化療。 2．2組織處理手術(shù)切除標本一半經(jīng)85％酒精固定、石蠟包埋、連續(xù)切片，進行組織病理學檢查，一半立即置-80℃低溫冰箱中，用于冰凍切片和DNA提取。 2．3試驗方法2．3．1免疫組織化學染色采用冰凍切片免疫組織化學ABC法檢測：RASSF1A蛋白表達，鼠抗人RASSF1A單克隆抗體(美國eBioseience公司)工作液濃度為原液的1／500。

7、2．3．2甲基化特異性PCR對于RASSF1A基因啟動子區(qū)甲基化水平的檢測采用1996年Herman等提出的甲基化特異性PCR方法(methylation-specific polymerase chain reaction，MSP)。原理：DNA在亞硫酸氫鹽的作用下，未甲基化的胞嘧啶(C)發(fā)生脫氨基反應(yīng)轉(zhuǎn)變成了尿嘧啶(U)，發(fā)生甲基化的5-甲基胞嘧啶(5-<'m>C)不發(fā)生轉(zhuǎn)變，因此處理后的DNA序列將出現(xiàn)不同的情況，基于這兩種情況設(shè)

8、計了甲基化與非甲基化特異性引物。對同一例修飾后的DNA分別用甲基化與非甲基化特異性引物擴增，二者將至少有一個擴增。根據(jù)上面的原理，就可以由特異性引物判斷原來DNA的甲基化狀態(tài)。 2.4統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，各組間的比較采用x<'2>檢驗，一致性分析采用Kappa檢驗，顯著性水準取a=0.05。 3.結(jié)果 3.1青年SCC的檢出率及臨床病理特征3.1.1三家醫(yī)院14814例SCC患者中共有青年SCC患

9、者625例，占同期SCC患者的4％。但三家醫(yī)院青年患者占同期SCC患者的比例并不相同。磁縣人民醫(yī)院最高(8％)，分別是林州中心醫(yī)院(2％)和姚村食管癌醫(yī)院(4％)的4倍和2倍，差異顯著(P<0.05)。 3.1.2同一家醫(yī)院不同年份青年SCC患者占同期SCC患者的比例并不相同。姚村食管癌醫(yī)院1976-1997的比例(7％)顯著高于1998-2006年(2％)(P<0.05)；磁縣人民醫(yī)院1974-1997的比例(9％)是1998

10、-2006年(3％)的3倍(P<0.05)。 3.1.3 625例青年SCC患者男女比例為1.72，與中老年SCC患者男女比例1.71相似(P>0.05)。 3.1.4青年(24％)與中老年(26％)患者淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移的比例相似(P>0.05)。其中男性淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移的比例高于女性(青年：25％vs.21％；中老年27％vs.25％；P<0.05)。青年SCC高分化的比例高于中老年(10％vs.7％；P>0.05)。青年

11、SCC浸潤纖維膜的比例低于中老年患者(P<0.05)。 3.2青年GCA的檢出率等流行病學特征3.2.1三家醫(yī)院33年7457例GCA患者中共有青年GCA患者196例，占同期GCA患者的3％。青年GCA的檢出率三家醫(yī)院相似。 3.2.2青年GCA患者男女比值為2.84，低于中老年GCA患者男女比例3.36(5594/1667)，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 3.3三家醫(yī)院SCC和GCA流行特征比較3.3.

12、1青年GCA占青年SCC和GCA的比值為24％，低于中老年GCA的這一比值(33％)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。磁縣人民醫(yī)院青年GCA在SCC和GCA中的構(gòu)成比最低(18％)，中心醫(yī)院最高30％(P=0.011)；磁縣人民醫(yī)院總的GCA在SCC和GCA中的構(gòu)成比(36％)高于姚村食管癌醫(yī)院(34％)(P<0.05)。 3.RASSF1A蛋白表達3.4.1青年SCC組織RASSF1A蛋白表達高于老年，差異顯著(83％，40

13、％，P<0.05)；同樣的情況見于青年GCA組織(89％，36％，P<0.05)。 3.4.2 RASSF1A在青年SCC和GCA組織中陽性表達頻率均較高(83％，10/12vs89％，8/9)，與對應(yīng)正常組織中的表達差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但表達類型并不相同。 3.43老年SCC組織RASSF1A蛋白表達低于食管正常上皮組織(40％，77‰P>0.05)；同樣的情況見于老年GCA組織和正常上皮組織，后者差異

14、顯著(36％，91％，P<0.05)。 3.4.4 SCC和GCA組織RASSFlA蛋白陽性表達率相似(P>0.05)。 3.5 RASSF1A基因啟動子甲基化3.5.1青年SCC組織RASSF1A基因啟動子甲基化率高于老年，但差異無統(tǒng)計學意義(46％，15％)。同樣的情況見于青年和老年GCA組織(60％，30％)。 3.5.2青年(60％，40％)和老年(30％，29％)GCA組織RASSF1A基因啟動子甲基化

15、率稍高于正常上皮組織，但差異無統(tǒng)計學意義；同樣的情況見于青年SCC和正常上皮組織(46％，33％，P>0.05)。 3.6 RASSF1A基因啟動子甲基化與RASSF1A蛋白表達的關(guān)系3.6.1 RASSF1A基因啟動子發(fā)生甲基化的19例組織中，僅有2例(11％)出現(xiàn)RASSFlA蛋白陰性表達；RASSF1A基因啟動子未發(fā)生甲基化的44例組織中，有21例(52％)出現(xiàn)RASSF1A蛋白陰性表達。 3.7 RASSF1A基

16、因啟動子甲基化和RASSF1A蛋白表達與患者臨床病理特征的關(guān)系。 3.7.1青年與老年SCC和GCA組織RASSF1A基因啟動子甲基化率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，分化程度及浸潤深度均沒有相關(guān)性。 3.7.2青年與老年SCC和GCA組織RASSF1A蛋白的陽性表達率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，分化程度及浸潤深度均沒有相關(guān)性。 4．結(jié)論 4．1華北太行山高發(fā)區(qū)青年SCC和GCA并不罕見(青年SCC：2％-9％；青年GCA-2％-3％)

17、，青年SCC的組織病理特征，包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，浸潤深度和分化程度與中老年SCC患者相似。 4．2青年SCC和GCA組織RASSF1A蛋白表達高于老年，提示青年與老年SCC和GCA具有不同的分子基礎(chǔ)，RASSF1A蛋白陽性表達是高發(fā)區(qū)青年SCC和GCA組織中常見的分子事件。 4．3青年SCC和GCARASSF1A啟動子甲基化率分別為46％和60％，提示，RASSFlA啟動子甲基化是青年SCC和GCA頻發(fā)的分子事件，可能在青年