腫瘤相關自身抗體和RASSF1A SNP對食管-賁門癌早期發(fā)現(xiàn)和高危人群預警的研究.pdf

1、河南林州(原林縣)是中國，也是世界上食管/賁門癌發(fā)病率和死亡率最高的地區(qū)。目前食管/賁門癌仍然是該地區(qū)腫瘤相關主要死亡原因。中晚期食管質門癌預后極差，5年生存率僅10％左右。但是，早期食管/賁門癌5年生存率可達90％以上。然而，由于早期患者缺乏特異癥狀，臨床上首次就診時90％左右的患者為中晚期。缺乏有效的高危人群預警和早期診斷的生物學指標和方法是造成臨床上食管癌患者就診時間過晚，死亡率高的主要原因。很顯然，闡明食管和賁門癌變的分子機制，

2、篩選和確定用于高危人群預警和早期發(fā)現(xiàn)的分子指標是降低食管和賁門癌死亡率的重要策略和措施。 目前，內鏡檢查和粘膜活檢、組織病理學檢查，特別是對高發(fā)區(qū)無癥狀居民普查和隨訪，仍然是發(fā)現(xiàn)早期癌和癌前病變患者最有效的手段。但是，內鏡普查耗資，耗時，并有一定的不適，不適合在高發(fā)區(qū)大規(guī)模無癥狀人群中進行普查。 我們實驗室及其它實驗室近年的研究提示：(1)p53-Rb系統(tǒng)變化，是食管和賁門癌變過程中發(fā)生頻率最高的分子事件；(2)這些分子

3、改變還隨病變程度加重而升高；(3)機體對這些分子改變可產生不同程度的自身抗體，這些自身抗體可以在食管/賁門癌和各級癌前病變患者的血中檢測到；(4)血清自身抗體水平與組織中相應抗原表達相一致。這些研究結果提示這些分子可能是食管/賁門癌早期發(fā)現(xiàn)和高危人群預警的重要分子標志物。本研究是在此基礎上，通過檢測河南林州食管/賁門癌高發(fā)區(qū)無癥狀居民血清中腫瘤相關自身抗體，篩查各級癌前病變和可疑癌患者，并對這些可疑患者進一步做內鏡和粘膜活檢組織病理學檢

4、查，闡明自身抗體檢測在食管/賁門癌早期發(fā)現(xiàn)和高危人群預警中的應用價值和意義。此外，最近的研究顯示腫瘤抑制基因Ras相關區(qū)域家族1A(Ras associationdomain family 1A gene，RASSF4A)單核苷酸多態(tài)(single nucleotide polymorphism，SNP)改變與甲基化在乳腺癌和肺腺癌的發(fā)生中起重要作用，是腫瘤易感性升高的分子基礎之一。發(fā)生RASSF1A改變的乳腺和肺癌前病變患者癌變率明顯

5、高于無RASSF1A改變的患者。根據(jù)人類單體型計劃最新公布的數(shù)據(jù)，在我國人群中也存在RASSF1A(Ala133 Ser)多態(tài)位點。作者的假設是食管癌和賁門癌有相似的遺傳因素，RASSF1A基因遺傳變異可能增加食管癌和賁門癌的易感性。但是有關RASSF1A(Ala133 Ser)基因SNP與河南食管和賁門癌高發(fā)區(qū)易感性的關系研究甚少，因此本研究以河南食管癌和賁門癌高發(fā)區(qū)人群為對象，探討RASSF1A(Ala133 Ser)基因SNP與食

6、管癌和賁門癌易感性的關系，為高危人群篩選提供更多理論信息和手段。 2材料與方法 2．1研究對象 對河南林州食管/賁門癌高發(fā)區(qū)3個自然村的863例無癥狀居民作流行病學調查和抽血檢查。其中男性284人，女性578人，平均年齡55±11歲。流行病學調查前先由當?shù)卮甯刹亢袜l(xiāng)村醫(yī)生幫助發(fā)放和講解知情同意書，對同意接受檢查的人開始詢問病史并進行體檢，填寫基本信息調查表，包括各種腫瘤的家族史。所有被檢者均排除急性感染、過敏、自

7、身免疫性疾病等影響血清蛋白質表達的疾病。另外收集112例食管鱗狀細胞癌患者(男68例，平均年齡57±10歲；女44例，平均年齡59±10歲)和116例賁門腺癌患者(男70例，平均年齡55±10歲；女46例，平均年齡60±10歲)的病理標本，患者均來自于2000年至2005年間河南林州食管癌醫(yī)院收治的食管癌和賁門癌病人。 2．2技術路線 2．2．1對河南林州食管/賁門癌高發(fā)區(qū)無癥狀居民作流行病學調查和抽血檢查腫瘤相關自身抗

8、體，自身抗體陽性者進一步作內鏡檢查，粘膜活檢和病理組織學及免疫組化檢查。選擇與自身抗體陽性者相匹配人數(shù)的自身抗體陰性者同樣作上述檢查。 2．2．2對照分析腫瘤相關自身抗體檢測對食管癌早期發(fā)現(xiàn)和高危人群預警中的應用價值和意義。 2．2．3對河南林州食管癌醫(yī)院收治的食管癌和賁門癌病理標本提取DNA，作RASSF1A(Ala133 Set)基因SNP分型。選擇與腫瘤病人相匹配的河南林州食管/賁門癌高發(fā)區(qū)無癥狀居民血中提取的DN

9、A，作同樣的RASSF1A(Ala133 Ser)基因SNP分型。 2．2．4對照分析RASSF1A(Ala133 Ser)基因SNP與食管癌和賁門癌易感性的關系。 2．3實驗方法 2．3．1血樣采集與保存對863例研究對象每例均取空腹靜脈血5ml至離心管中，室溫下靜置30分鐘，而后2000轉/分離心20分鐘，吸取血清每管100μl分裝，液氮保存，普查結束后轉至-80℃冰箱內儲存?zhèn)溆谩?2．3．2血清自身

10、抗體檢測用美國Scripps研究所自行提取和純化的C-myc、cyclinB1、IMP1、Koc、p16、p53、p62、Survivin共8種抗原對以上血清標本進行檢測。采用本實驗室已建立的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗方法，各包被抗原的稀釋終濃度為0．5μg/μl，血樣稀釋濃度為1：50，辣根過氧化物酶標記的抗人IgG稀釋濃度為1：5000。在Elisa 板孔中加入用包被稀釋液稀釋過的抗原100μl/孔，4℃，過夜(24h以上)。加入稀釋后的

11、病人血清100μl/孔，每個樣品至少做兩次檢查，37℃孵育。已知陽性的血清為陽性對照，包被緩沖液為陰性對照。加入稀釋的辣根過氧化物酶標記的抗人IgG 100μl/孔，37℃孵育。加入TMB-過氧化氫尿素顯色液，100μl/孔，置37℃避光反應，當陽性對照出現(xiàn)明顯顏色變化后，每孔加入終止液50μl終止反應，并在Elisa Reader讀取OD<,450>光密度值。 2．3．3血清自身抗體檢測結果判定采用Scripps研究所判定方法

12、，即正常血清OPD讀數(shù)均數(shù)±3標準差，即Cut-off值(截斷值)，讀數(shù)在此值以上的為陽性，否則為陰性。 2．3．4食管內鏡檢查和粘膜活檢對血清學檢測8種自身抗體有至少1種陽性者和大致相匹配例數(shù)的陰性者進行內鏡檢查，并常規(guī)在食管中1/3段(距門齒30cm～32cm)和下1/3段(食管、賁門交界線上2cm～3cm)和賁門(齒狀線下2cm)各取1～2塊活檢組織，并在肉眼可見的病變處隨機取材，必要時進行食管粘膜碘染色和賁門粘膜美藍染色

13、，在食管不染區(qū)和賁門染區(qū)取材，所有活檢組織均迅速置95％乙醇內固定。常規(guī)脫水后石蠟包埋，連續(xù)切片9張，每張切片厚5μm，其中1張作HE染色，核實組織病理學診斷，其余8張作免疫組化檢查。 2．3．5病理組織學和免疫組化檢查根據(jù)細胞形態(tài)和組織結構，將食管上皮分為正常(Normal，NOR)，基底細胞過度增生(base cell hyperplasia，BCH)，不典型增生(dysplasia, DYS)，鱗狀細胞癌(Squamous

14、 Cell Carcinoma，SCC)。檢測食管上皮組織中上述8個相關抗原采用免疫組化法。免疫蛋白陽性反應主要定位于細胞漿或細胞核，為棕黃色或棕褐色，高倍鏡下(x40)選取五個視野，無陽性細胞或陽性細胞數(shù)<10％為陰性；陽性細胞數(shù)=10％為陽性。 2．3．6 DNA的提取采用酚-氯仿法從食管和賁門癌組織和食管癌高發(fā)區(qū)無癥狀人群外周血中提取DNA,溶解于TE緩沖液，-80℃保存?zhèn)溆谩?2．4統(tǒng)計方法計量資料以均數(shù)±標準差

15、(x±S)表示，配對資料比較采用X<'2>檢驗。用精確概率法檢驗對照組人群各基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡，以判斷所選人群是否存在基因型或等位基因的分布偏差，從而確定其對整體人群的代表性。對于相對危險度的估計分析，采用“病例-對照”試驗設計，并用非條件logistic回歸模型計算比數(shù)比(Odds Ratios，OR)及95％可信區(qū)間(Confidential Intervals，CI)。所有統(tǒng)計皆采用SPSS13.0

16、統(tǒng)計軟件進行分析。以上檢驗水準均采用a=0.05。 4 結論 4．1聯(lián)合應用多種腫瘤相關抗原(C-myc、cyclinB1、IMP1、Koc、p16、p53、p62和Survivin)在食管癌高發(fā)區(qū)部分無癥狀人群中可檢測出相應的自身抗體。 4．2自身抗體陽性組食管上皮組織的癌前病變發(fā)生率明顯高于自身抗體陰性組(P<0.01)。 4．3組織和血清配對的血清中自身抗體陽性表達與抗原在食管上皮組織中的陽性表達有

17、關聯(lián)性r=0.479(P<0.01)。 4．4據(jù)血清自身抗體檢測陽性結果作食管內鏡檢查，可縮小普查人群，提高食管癌前病變和早期食管癌的檢出率。對食管癌高發(fā)區(qū)高危人群預警和早期發(fā)現(xiàn)食管癌有一定意義。 4．5 RASSF1A(Ala133 Ser)SNP的Ala/Ala、Ala/Ser和Ser/Ser基因型頻率在食管癌病人組與對照組之間無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。但是，賁門癌病人組與對照組有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。雜合