強(qiáng)心甙類藥物誘導(dǎo)人非小細(xì)胞型肺癌細(xì)胞自噬機(jī)制研究.pdf

1、強(qiáng)心甙類藥物能與真核細(xì)胞膜鈉鉀ATP酶(Na+/K+-ATPase)特異性結(jié)合，抑制該酶的活性，因此多年來被用于充血性心力衰竭和心律失常的治療。越來越多的研究表明Na+/K+-ATPase抑制劑對(duì)多種器官組織來源的腫瘤有較好的抑制活性，但其作用機(jī)制并未得到全面深入的闡釋。肺癌是當(dāng)今世界發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，而非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)則約占肺癌發(fā)病的80％。在本研究中，我們以植物來源的地高辛和哇巴因作為代表性的強(qiáng)心甙類藥物，

2、采用人非小細(xì)胞型肺癌細(xì)胞作為強(qiáng)心甙類藥物的作用對(duì)象，主要在A549和H460細(xì)胞中進(jìn)行研究，探討地高辛或哇巴因誘導(dǎo)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自噬發(fā)生的條件及其相關(guān)信號(hào)通路變化，并研究自噬與藥物引起的抗腫瘤活性之間的關(guān)系。
　　 首先我們采用MTT法檢測(cè)兩種藥物分別對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用，發(fā)現(xiàn)該類藥物在納摩爾水平就能有效地抑制多種人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系生長，且其抗腫瘤活性是順鉑的104倍。熒光定量PCR檢測(cè)Na+/K+-ATPaseα3與

3、α1亞基基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)α3/α1比值可能與強(qiáng)心甙類藥物的抗腫瘤活性相關(guān)。我們?cè)诎霐?shù)抑制濃度(IC50)范圍進(jìn)行下一步機(jī)制研究。流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)兩種藥物在該濃度下，引起A549或H460細(xì)胞部分G2/M期阻滯；除哇巴因處理的H460組Sub-G1的細(xì)胞比例約占13.2％外，兩種藥物誘導(dǎo)的Sub-G1比例均在5％以下。同時(shí)，Hoechst33342染色觀察到的細(xì)胞核型變化和westernblotting檢測(cè)凋亡標(biāo)志蛋白PARP的結(jié)果均說明在此

4、濃度下，該類藥物較少引起細(xì)胞凋亡。
　　 進(jìn)一步的研究采用PBS饑餓作為自噬的陽性對(duì)照組，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)心甙類藥物處理與饑餓組出現(xiàn)相似的自噬相關(guān)表型變化。在地高辛或哇巴因短時(shí)間作用下，westernblotting檢測(cè)到自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)顯著升高，自噬相關(guān)蛋白Atg5/12復(fù)合物和Beclin1的表達(dá)也明顯增加；利用吖啶橙染色觀察到細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)酸性空泡；電子透射顯微鏡檢測(cè)到胞質(zhì)中自噬體和自噬空泡的形成，并通過熒光顯微鏡捕捉到G

5、FP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)的點(diǎn)狀凝集現(xiàn)象，其中地高辛或哇巴因作用A549細(xì)胞后GFP-LC3陽性細(xì)胞分別約占17.3％或16.0％，陽性率較正常對(duì)照組顯著增加(P＜0.01)。機(jī)制研究顯示該類藥物通過上調(diào)AMPK活性以及TSC2蛋白表達(dá)水平，有效地抑制mTOR信號(hào)通路，尤其對(duì)mTOR下游分子4E-BP1的抑制作用強(qiáng)于S6K1，而mTOR的另一個(gè)上游分子Akt的活性在藥物處理后沒有明顯變化。此外，本研究結(jié)果顯示強(qiáng)心甙類藥物能夠激活由

6、Src介導(dǎo)MEK1/2/ERK1/2信號(hào)通路，該通路對(duì)藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬起著正調(diào)節(jié)作用。我們給予自噬抑制劑或是對(duì)信號(hào)通路相關(guān)蛋白進(jìn)行siRNA干擾發(fā)現(xiàn)，這些干預(yù)手段可顯著逆轉(zhuǎn)藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬表型包括LC3-Ⅱ表達(dá)降低、GFP-LC3點(diǎn)狀凝集細(xì)胞數(shù)減少以及信號(hào)通路變化。同時(shí)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)自噬表型的逆轉(zhuǎn)導(dǎo)致藥物抗腫瘤活性降低，提示藥物誘導(dǎo)的自噬發(fā)揮著抗腫瘤作用。此外，我們初步研究了強(qiáng)心甙類藥物激活的激酶通路之間的相互關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Src蛋白處于

7、AMPK上游，介導(dǎo)了藥物誘導(dǎo)的AMPK活化，而ERK1/2激酶則處于AMPK下游。
　　 綜上所述，強(qiáng)心甙類藥物對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系具有顯著的抗腫瘤活性，在IC50濃度范圍，該類藥物一方面誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生周期阻滯；另一方面通過調(diào)節(jié)AMPK/mTOR和Src/ERK1/2雙重信號(hào)通路誘導(dǎo)人非小細(xì)胞型肺癌細(xì)胞發(fā)生自噬，這種自噬作用至少部分解釋了藥物的抗腫瘤活性。本研究從另一新穎角度深入闡釋了靶向Na+/K+-ATPase的強(qiáng)心甙類藥物