mTORC2-Rictor調(diào)控非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移的分子機制研究.pdf

1、目的:
　　 肺癌是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一，在我國肺癌的發(fā)病率和死亡人數(shù)位于惡性腫瘤的第一位。目前的研究認為轉(zhuǎn)移的發(fā)生是導致臨床腫瘤患者治療失敗和死亡的主要原因，而癌細胞的趨化運動和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在腫瘤轉(zhuǎn)移過程起非常重要的作用，因此明確調(diào)控癌細胞趨化運動和EMT發(fā)生的詳細分子機制對于研究腫瘤轉(zhuǎn)移具有非常重要的意義，同時可以為臨床轉(zhuǎn)移腫瘤的診斷和治療提供新的潛在靶點。
　　 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)構(gòu)成雷帕霉素

2、不敏感的蛋白激酶復合體mTORC2的關(guān)鍵分子Rictor在多種癌組織中高表達，而且與患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，目前對mTORC2/Rictor在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的詳細作用機制并不清楚。在本次研究中我們擬采用小RNA干擾等一系列分子生物學和細胞生物學研究技術(shù)、并結(jié)合EGF誘導的肺癌細胞趨化運動和TGFβ誘導的肺癌細胞EMT發(fā)生模型，分析探討mTORC2/Rictor在調(diào)節(jié)肺癌細胞遷移和轉(zhuǎn)移能力中的作用機制，最后在免疫缺陷小鼠轉(zhuǎn)移模型中驗證Ric

3、tor表達下調(diào)對肺癌細胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　 方法:
　　 1)采用基于慢病毒的小RNA干擾技術(shù)下調(diào)Rictor在肺癌細胞中的表達水平，研究其表達下調(diào)對EGF誘導的肺癌細胞趨化運動能力的影響;
　　 2)采用傷口愈合實驗分析Rictor表達下調(diào)對劃痕誘導的肺癌細胞極化和定向遷移能力的影響;采用粘附實驗觀察肺癌細胞中Rictor表達下調(diào)對細胞外基質(zhì)粘附能力的影響;分析Rictor表達下調(diào)對EGF誘導的細胞骨架

4、蛋白F-actin聚合能力的影響;
　　 3)采用Westemblotting的方法研究Rictor表達下調(diào)對EGF誘導的下游信號分子激活的影響;
　　 4)采用免疫熒光染色和Western blotting的方法研究Rictor表達下調(diào)對TG耶誘導的肺癌細胞EMT發(fā)生的影響;
　　 5)采用免疫熒光染色和Western blotting的方法分析Rictor表達下調(diào)對TGFβ誘導的經(jīng)典Smads通路和非經(jīng)典Sm

5、ads通路中mTORC2/Akt、Erk1/2和 GSK3β/β-catenin信號通路激活的影響;
　　 6)采用免疫熒光染色和Western blotting的方法研究抑制GSK3β活性對TGFβ誘導的肺癌細胞EMT發(fā)生的影響;
　　 7)采用免疫熒光染色和Western blotting的方法分析下調(diào)β-catenin的表達對TGFβ誘導的肺癌細胞EMT發(fā)生的影響;
　　 8)采用免疫組織化學的方法分析Ri

6、ctor在肺癌組織中的表達情況;
　　 9)在免疫缺陷小鼠轉(zhuǎn)移模型中研究下調(diào)Rictor的表達對肺癌細胞轉(zhuǎn)移能力的影響;
　　 結(jié)果:
　　 1)下調(diào)Rictor的表達明顯抑制了EGF誘導的蛋白激酶Akt的磷酸化，同時抑制了EGF誘導的肺癌細胞的趨化運動能力和劃痕誘導細胞極性的重新建立和定向遷移能力;而且Rictor降表達的細胞對Fibronectin的粘附能力明顯降低，對EGF誘導的F-actin聚合能力也明顯

7、下降;
　　 2)下調(diào)肺癌細胞A549中Rictor的表達導致細胞中上皮標志性蛋白E-cadheirn表達升高和間質(zhì)標志性蛋白Vimentin的表達下降即細胞發(fā)生類MET變化;
　　 3)下調(diào)Rictor的表達明顯抑制了TGFβ誘導的非小細胞肺癌A549和H358細胞EMT的發(fā)生;
　　 4)下調(diào)Rictor的表達對TGFβ誘導的經(jīng)典Smads通路以及Erk1/2的激活沒有明顯影響，但是抑制了TGFβ誘導的Akt

8、473位點的磷酸化和GSK3β的磷酸化，同時抑制了TGFβ誘導的β-catenin向細胞核轉(zhuǎn)位;
　　 5)采用GSK3β的抑制劑LiC1抑制Rictor表達下降細胞中GSK3β的活性可以恢復TGFβ誘導的EMT的發(fā)生;
　　 6)下調(diào)β-catenin的表達可以明顯抑制TGFβ誘導肺癌細胞EMT的發(fā)生，但是對TGFβ誘導的經(jīng)典Smads通路和非經(jīng)典Smads通路沒有明顯影響;
　　 7)免疫組化的結(jié)果顯示Ric

9、tor在肺癌組織中表達上調(diào)，而且Rictor表達上調(diào)與患者出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)，但是與患者的年齡、性別、TNM分期和淋巴結(jié)狀態(tài)沒有明顯相關(guān)性;
　　 8)免疫缺陷小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型顯示下調(diào)Rictor的表達明顯抑制了肺癌細胞的轉(zhuǎn)移能力。
　　 結(jié)論:
　　 下調(diào)Rictor的表達可以明顯抑制非小細胞肺癌細胞在體外的遷移能力和免疫缺陷小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移能力，表明Rictor是調(diào)節(jié)癌細胞遷移和轉(zhuǎn)移能力的一個非常關(guān)鍵的因子。進一

10、步的研究發(fā)現(xiàn)Rictor主要通過調(diào)節(jié)癌細胞的趨化運動和腫瘤的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化兩個方面從而促進腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。一方面，Rictor調(diào)節(jié)肺癌細胞的趨化運動主要通過與mTOR形成的蛋白激酶復合體mTORC2而實現(xiàn)，Rictor/mTORC2通過調(diào)節(jié)蛋白激酶Akt的活性繼而傳遞了EGF誘導的趨化運動信號通路。下調(diào)Rictor的表達抑制了劃痕誘導的癌細胞極性重新建立和定向遷移能力;癌細胞對細胞外基質(zhì)的粘附能力以及細胞遷移過程中細胞骨架蛋白F-acti

11、n的重構(gòu)能力從而抑制了細胞的趨化運動。另一方面下調(diào)Rictor的表達誘導肺癌細胞A549發(fā)生類MET變化，說明mTORC2是維持間質(zhì)細胞表型所必須的。機理方面的研究發(fā)現(xiàn)mTORC2/Rictor介導TGFβ誘導肺癌細胞EMT發(fā)生主要通過交叉激活Wnt通路中的GSK3β/β-catenin信號通路，從而調(diào)節(jié)EMT發(fā)生相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄而實現(xiàn)。我們的研究結(jié)果提示Rictor/mTORC2調(diào)節(jié)癌細胞的EMT和趨化運動兩者之間是相互促進和相互協(xié)作的