Rictor在腎癌轉移中的功能研究及分子機制探討.pdf

1、研究背景和目的：
　　腎細胞癌是腎組織腫瘤中最常見的一種腫瘤，其中50％以上的腎癌患者死于腫瘤轉移。因此，為了準確判斷預后及對病人實行個體化治療，進一步了解腫瘤轉移的生物學機制及篩選腫瘤轉移的相關生物標記物成了當務之急。近年來，越來越多的研究顯示腫瘤微環(huán)境中的細胞因子，尤其是腫瘤壞死因子?會增強腎癌的運動能力，進而增加腎癌的轉移。然而，其調(diào)節(jié)腫瘤細胞轉移的機制尚不明確。
　　Rictor是組成mTORC2的關鍵分子，其功能涉

2、及到調(diào)節(jié)細胞骨架重構、細胞遷移、細胞存活和增殖等方面上。我們課題組之前的研究表明mTORC2中的Rictor在乳腺癌組織中高表達，并與患者淋巴結轉移的出現(xiàn)密切相關，降低腫瘤細胞中 Rictor的表達可以明顯抑制腫瘤細胞的運動和轉移。但是目前有關mTORC2/Rictor的功能研究還處于初步探討階段，尤其在腎癌運動轉移方面的研究更為有限。
　　本研究第一部分主要通過體內(nèi)外實驗探討Rictor在腎癌轉移的功能作用。本研究第二部分則運用

3、細胞生物學和分子生物學實驗方法，研究促炎因子TNFα處理對腎癌細胞運動能力的影響，以及Rictor在該過程中的功能及其分子機制，以明確 Rictor在 TNFα促進腫瘤細胞運動這一現(xiàn)象中的作用。希望本研究能深化人們對腫瘤轉移分子機制的認識，力求能為臨床提早發(fā)現(xiàn)和治療腫瘤轉移提供新的思路、觀點和依據(jù)。
　　研究方法：
　　1)應用慢病毒包裝系統(tǒng)感染人腎癌細胞系ACHN，利用Western Blotting和實時定量PCR技術檢

4、測Rictor降表達效率。
　　2)利用劃痕實驗、趨化實驗以及侵襲實驗觀察穩(wěn)定降表達 Rictor細胞的運動能力的變化。
　　3)利用嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠建立腫瘤移植瘤轉移模型，根據(jù)小鼠肝、肺組織HE染色結果研究下調(diào)Rictor的表達對腎癌細胞轉移能力的影響，并通過計算原發(fā)瘤體積初步評估下調(diào)Rictor的表達對腎癌細胞增殖能力的影響。
　　4)應用劃痕實驗、趨化實驗和侵襲實驗觀察TNFα處理后ACHN細胞運動能力的改變

5、，以及降表達Rictor對TNFα處理后ACHN細胞運動能力的影響。
　　5)應用 Western Blotting和實時定量技術檢測 TNFα處理后 ACHN細胞內(nèi)Rictor的表達情況。
　　6)應用Western Blotting和免疫熒光技術分別檢測TNFα處理后ACHN細胞內(nèi)IκBα的含量和磷酸化的變化，以及p65細胞內(nèi)轉位的情況。
　　7)應用螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)和染色體免疫共沉淀技術分析 RICTOR

6、啟動位點上游序列，以探究RICTOR的轉錄調(diào)控機制。
　　結果：
　　1)慢病毒感染后，ACHN細胞內(nèi)Rictor表達量明顯下調(diào)。
　　2)穩(wěn)定降表達Rictor的ACHN細胞相比空白組和對照組運動能力明顯減弱。
　　3)穩(wěn)定降表達Rictor的ACHN細胞在小鼠肺和肝臟轉移少于實驗對照組，且穩(wěn)定降表達Rictor的腎癌細胞相比對照組在小鼠體內(nèi)的成瘤能力降低。
　　4) TNFα處理能增強AHCN對照組細胞

7、的遷移和EGF誘導下的趨化和侵襲能力，而降表達Rictor能夠抑制TNFα處理對細胞運動的增強作用。
　　5) Western Blotting和RT-PCR結果證實TNFα處理可以在mRNA和蛋白水平上增加ACHN細胞內(nèi)Rictor表達。
　　6) Western Blotting結果顯示TNFα處理后，ACHN細胞中的IκBα表達量可見明顯降低，而磷酸化的IκBα可見明顯升高。免疫熒光結果則證實TNFα處理后，轉錄因子p

8、65從胞漿轉位至胞核。
　　7)螢光素酶報告基因檢測結果顯示RICTOR轉錄起始位點上游-51bp至-301bp區(qū)域的缺失時，該序列的轉錄活性明顯下降。染色體免疫共沉淀實驗則進一步證實p65能富集在該區(qū)域。
　　結論：
　　1)體內(nèi)外實驗顯示Rictor與腎癌細胞轉移能力和增殖能力相關，降表達Rictor可以抑制腎癌細胞的運動轉移能力和成瘤能力。
　　2)TNFα能夠激活ACHN細胞中NF-κB通路，進而增加細胞