Rictor在腎癌轉(zhuǎn)移中的功能研究及分子機(jī)制探討.pdf

1、研究背景和目的：
　　腎細(xì)胞癌是腎組織腫瘤中最常見的一種腫瘤，其中50％以上的腎癌患者死于腫瘤轉(zhuǎn)移。因此，為了準(zhǔn)確判斷預(yù)后及對(duì)病人實(shí)行個(gè)體化治療，進(jìn)一步了解腫瘤轉(zhuǎn)移的生物學(xué)機(jī)制及篩選腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)生物標(biāo)記物成了當(dāng)務(wù)之急。近年來，越來越多的研究顯示腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子，尤其是腫瘤壞死因子?會(huì)增強(qiáng)腎癌的運(yùn)動(dòng)能力，進(jìn)而增加腎癌的轉(zhuǎn)移。然而，其調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不明確。
　　Rictor是組成mTORC2的關(guān)鍵分子，其功能涉

2、及到調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重構(gòu)、細(xì)胞遷移、細(xì)胞存活和增殖等方面上。我們課題組之前的研究表明mTORC2中的Rictor在乳腺癌組織中高表達(dá)，并與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)密切相關(guān)，降低腫瘤細(xì)胞中 Rictor的表達(dá)可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和轉(zhuǎn)移。但是目前有關(guān)mTORC2/Rictor的功能研究還處于初步探討階段，尤其在腎癌運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)移方面的研究更為有限。
　　本研究第一部分主要通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探討Rictor在腎癌轉(zhuǎn)移的功能作用。本研究第二部分則運(yùn)用

3、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，研究促炎因子TNFα處理對(duì)腎癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響，以及Rictor在該過程中的功能及其分子機(jī)制，以明確 Rictor在 TNFα促進(jìn)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)這一現(xiàn)象中的作用。希望本研究能深化人們對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，力求能為臨床提早發(fā)現(xiàn)和治療腫瘤轉(zhuǎn)移提供新的思路、觀點(diǎn)和依據(jù)。
　　研究方法：
　　1)應(yīng)用慢病毒包裝系統(tǒng)感染人腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN，利用Western Blotting和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢

4、測(cè)Rictor降表達(dá)效率。
　　2)利用劃痕實(shí)驗(yàn)、趨化實(shí)驗(yàn)以及侵襲實(shí)驗(yàn)觀察穩(wěn)定降表達(dá) Rictor細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力的變化。
　　3)利用嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠建立腫瘤移植瘤轉(zhuǎn)移模型，根據(jù)小鼠肝、肺組織HE染色結(jié)果研究下調(diào)Rictor的表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響，并通過計(jì)算原發(fā)瘤體積初步評(píng)估下調(diào)Rictor的表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞增殖能力的影響。
　　4)應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)、趨化實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)觀察TNFα處理后ACHN細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的改變

5、，以及降表達(dá)Rictor對(duì)TNFα處理后ACHN細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響。
　　5)應(yīng)用 Western Blotting和實(shí)時(shí)定量技術(shù)檢測(cè) TNFα處理后 ACHN細(xì)胞內(nèi)Rictor的表達(dá)情況。
　　6)應(yīng)用Western Blotting和免疫熒光技術(shù)分別檢測(cè)TNFα處理后ACHN細(xì)胞內(nèi)IκBα的含量和磷酸化的變化，以及p65細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)位的情況。
　　7)應(yīng)用螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)和染色體免疫共沉淀技術(shù)分析 RICTOR

6、啟動(dòng)位點(diǎn)上游序列，以探究RICTOR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1)慢病毒感染后，ACHN細(xì)胞內(nèi)Rictor表達(dá)量明顯下調(diào)。
　　2)穩(wěn)定降表達(dá)Rictor的ACHN細(xì)胞相比空白組和對(duì)照組運(yùn)動(dòng)能力明顯減弱。
　　3)穩(wěn)定降表達(dá)Rictor的ACHN細(xì)胞在小鼠肺和肝臟轉(zhuǎn)移少于實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，且穩(wěn)定降表達(dá)Rictor的腎癌細(xì)胞相比對(duì)照組在小鼠體內(nèi)的成瘤能力降低。
　　4) TNFα處理能增強(qiáng)AHCN對(duì)照組細(xì)胞

7、的遷移和EGF誘導(dǎo)下的趨化和侵襲能力，而降表達(dá)Rictor能夠抑制TNFα處理對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的增強(qiáng)作用。
　　5) Western Blotting和RT-PCR結(jié)果證實(shí)TNFα處理可以在mRNA和蛋白水平上增加ACHN細(xì)胞內(nèi)Rictor表達(dá)。
　　6) Western Blotting結(jié)果顯示TNFα處理后，ACHN細(xì)胞中的IκBα表達(dá)量可見明顯降低，而磷酸化的IκBα可見明顯升高。免疫熒光結(jié)果則證實(shí)TNFα處理后，轉(zhuǎn)錄因子p

8、65從胞漿轉(zhuǎn)位至胞核。
　　7)螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示RICTOR轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-51bp至-301bp區(qū)域的缺失時(shí)，該序列的轉(zhuǎn)錄活性明顯下降。染色體免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)則進(jìn)一步證實(shí)p65能富集在該區(qū)域。
　　結(jié)論：
　　1)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)顯示Rictor與腎癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力和增殖能力相關(guān)，降表達(dá)Rictor可以抑制腎癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)移能力和成瘤能力。
　　2)TNFα能夠激活A(yù)CHN細(xì)胞中NF-κB通路，進(jìn)而增加細(xì)胞