牛消化道Ⅰ型肽載體(bPepT Ⅰ)部分序列的克隆、表達(dá)及多克隆抗體的制備.pdf

1、牛消化道Ⅰ型肽載體（bPepTⅠ）蛋白表達(dá)量的檢測(cè)有助于小肽吸收營(yíng)養(yǎng)學(xué)重要性的研究。本研究應(yīng)用原核表達(dá)重組技術(shù)制備bPepTⅠ的多克隆抗體，以用于其蛋白表達(dá)量的免疫學(xué)測(cè)定。
　　 用DNAStar軟件對(duì)bPepTⅠ的DNA全序列進(jìn)行了抗原性指數(shù)分析，并結(jié)合該蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)，從胞外環(huán)篩選出高抗原性指數(shù)片段（bPepTⅠ ORF的1369-1695bp片段）。取牛瘤胃組織樣品，用Trizol法提取總RNA，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模

2、板，采用PCR擴(kuò)增技術(shù)，擴(kuò)增得到與預(yù)期大小相符的片段，命名為BP片段。將該片段與原核表達(dá)載體pGEX-6p-1和pET-32a連接，得到的正確重組質(zhì)粒分別命名為GST-BP和His-BP。采用限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切及測(cè)序方法雙重鑒定重組質(zhì)粒的正確性，結(jié)果表明，目的片段已定向克隆到原核表達(dá)載體上，且克隆的BP基因片段與Genbank登錄的標(biāo)準(zhǔn)序列有較高的同源性（99.1％），不會(huì)影響后續(xù)的蛋白表達(dá)工作。用鑒定正確的GST-

3、BP重組質(zhì).粒轉(zhuǎn)化BL21菌株，His-BP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核表達(dá)菌株BL21（DE3）。IPTG在不同時(shí)間和濃度下誘導(dǎo)GST-BP/BL21轉(zhuǎn)化菌株GST-BP/BL21外源蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)的重組菌處理后經(jīng)SDS-PAGE電泳確定IPTG最佳誘導(dǎo)條件。最佳條件下大量誘導(dǎo)GST-BP在BL21菌株中的表達(dá)，同時(shí)進(jìn)行重組載體His-BP在BL21（DE3）菌株中的誘導(dǎo)表達(dá)，應(yīng)用SDS-PAGE電泳和Westernblot方法相結(jié)合鑒定轉(zhuǎn)化菌

4、株表達(dá)蛋白的準(zhǔn)確性，結(jié)果表明，GST-BP/BL21表達(dá)得到38.1kDa左右的蛋白，His-BP/BL21（DE3）表達(dá)得到31kDa左右的蛋白，與預(yù)期的蛋白分子量大小相符，因此，試驗(yàn)成功獲得表達(dá)目的蛋白的重組菌株。
　　 培養(yǎng)GST-BP/BL21重組菌株，超聲波破碎菌體后確定表達(dá)蛋白的可溶性，結(jié)果表明，重組蛋白以包涵體的形式存在。包涵體蛋白電泳后，切下目的蛋白帶所在的膠條免疫小鼠，加強(qiáng)免疫3次后，小鼠尾靜脈采血，獲得目的蛋

5、白的抗血清。首先用His-BP融合蛋白做抗原，免疫印跡方法鑒定抗體的特異性，結(jié)果表明，本研究獲得了抗bPepTⅠ目標(biāo)片段的抗體。接著用不同濃度的GST-BP蛋白為包被抗原，不同稀釋度的抗血清做一抗，間接ELISA測(cè)定最佳工作條件結(jié)果表明，GST-BP抗原最佳包被濃度是0.5μg/mL，抗血清的最佳稀釋度是1:400。用包被緩沖液將GST-BP抗原稀釋至0.5μg/mL，鼠疫抗血清按1:400，1:1600，1:6400，1:25600，