應用5′錨定PCR法開發(fā)無瓣海桑微衛(wèi)星標記.pdf

1、無瓣海桑(Sonneratia apetala Buch.-Ham)，是紅樹林中優(yōu)良喬木樹種之一，天然分布于印度、孟加拉等國鹽度較低的泥質(zhì)灘涂，1985年我國首次將無瓣海桑在海南東寨港引種成功。由于無瓣海桑在速生性、抗逆性、耐寒性、防風御浪等方面明顯優(yōu)于其他紅樹林樹種，其引種范圍逐漸北擴，并成為華南沿海防護林體系建設中的優(yōu)良樹種之一。無瓣海桑的豐富遺傳多樣性決定其廣泛的生態(tài)適應，但對無瓣海桑的群體遺傳多樣性的研究還有待深入，特別是分子標

2、記的應用還不多見。SSR(simple sequence repeat，簡單重復序列)分子標記因其在真核生物基因組中含量豐富、多態(tài)性高、共顯性特點，廣泛應用于遺傳多樣性、遺傳圖譜的構(gòu)建等方面。目前無瓣海桑尚缺乏SSR標記。
　　 基于ISSR-PCR的5'錨定技術開發(fā)SSR標記操作簡單，對于基因組信息缺乏的物種來說，5'錨定PCR技術是一種開發(fā)SSR標記的有效的方法。本研究主要應用5'錨定PCR技術，通過構(gòu)建基因組文庫分離了無瓣

3、海桑的微衛(wèi)星序列。共設計了含有四類重復基元(AC、CA、CT和GA)的4組錨定簡并引物以無瓣海?；蚪MDNA為模板擴增SSR區(qū)域，擴增出DNA片段回收、連接、轉(zhuǎn)化后形成4個基因組SSR文庫，挑選陽性克隆測序，根據(jù)測序結(jié)果設計SSR引物?？偣矞y序的克隆片段有94個，得到兩端含有SSR基元的序列90個，其中的30個為冗余序列，最終得到了60個兩端含有SSR的單克隆序列，冗余率為32.0％。大部分克隆片段的SSR序列較短，平均重復數(shù)為8.32

4、。GA/CT基元平均重復數(shù)最大為10.25，TG/AC基元平均重復數(shù)最小為7.10。
　　 根據(jù)重復序列大于10的克隆片段設計出37對特異引物，以采自海南東寨港第一批引種至今成活的15株無瓣海?；蚪MDNA為模板，篩選出30對穩(wěn)定擴增的特異引物。這些穩(wěn)定擴增的引物中11對表現(xiàn)為單位點擴增，19對為多位點擴增。穩(wěn)定擴增的引物中5對擴增產(chǎn)物表現(xiàn)出明顯多態(tài)性，SSR位點等位基因最大值為3，平均等位基因2.4。
　　 本研究利用