應(yīng)用5’錨定PCR開發(fā)谷子微衛(wèi)星標(biāo)記.pdf

1、谷子(Setaria italica)，是二倍體(2n=2x=18)，基因組較小。雖然作為遺傳學(xué)研究的對(duì)象具有很多優(yōu)勢(shì)，但它的遺傳研究相對(duì)落后，許多重要性狀的基因有待發(fā)掘。SSR標(biāo)記是目前應(yīng)用很廣泛的分子標(biāo)記，這已在水稻、玉米、小麥等多種作物上證實(shí)，目前谷子尚缺乏SSR標(biāo)記。 基于ISSR-PCR的5'錨定PCR技術(shù)開發(fā)SSR標(biāo)記操作簡(jiǎn)單，對(duì)于基因組信息缺乏的谷子來說，5'錨定PCR技術(shù)是一種開發(fā)SSR標(biāo)記的有效的方法。本研究主

2、要應(yīng)用5'錨定PCR技術(shù)，以豫谷l為材料通過構(gòu)建基因組文庫分離了谷子的微衛(wèi)星序列?？偣苍O(shè)計(jì)了含有四類重復(fù)基元(GT/CA、TG/AC、GA/CT和AG/TC)8對(duì)錨定簡(jiǎn)并引物以谷子基因組DNA為模板擴(kuò)增SSR區(qū)域，擴(kuò)增出DNA片段回收后連接、轉(zhuǎn)化后形成八個(gè)基因組SSR文庫，挑選克隆測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)SSR引物。 總共測(cè)序的克隆片段有229個(gè)，得到兩端含有SSR基元的序列211個(gè)，其中的71個(gè)為冗余序列，最終得到了140個(gè)兩端

3、含有SSR的單克隆序列，冗余率為31.0％。大部分克隆片段的SSR序列較短，平均重復(fù)數(shù)為7.19。GA/CT基元平均重復(fù)數(shù)最大為8.03，GT/CA基元平均重復(fù)數(shù)最小為6.57。 根據(jù)這些克隆片段設(shè)計(jì)出222對(duì)特異引物，從中篩選出123對(duì)穩(wěn)定擴(kuò)增的特異引物。其中共有14對(duì)引物僅在幾份谷子材料中有擴(kuò)增，共有109對(duì)引物可以在谷子及青狗尾草的至少兩份狗尾草材料中擴(kuò)增，具有很強(qiáng)的通用性。 這些穩(wěn)定擴(kuò)增的引物中有56對(duì)引物在谷子

4、和青狗尾草中擴(kuò)增時(shí)具有多態(tài)性。其中有6對(duì)引物在僅在谷子中具有多態(tài)性，24對(duì)在谷子當(dāng)中表現(xiàn)為單態(tài)性擴(kuò)增的引物在青狗尾草中表現(xiàn)出明顯多態(tài)性，還有26對(duì)引物在谷子和青狗尾草中擴(kuò)增都能表現(xiàn)出多態(tài)性。 選擇擴(kuò)增較好的22對(duì)多態(tài)性SSR引物用作狗尾草屬19份材料的遺傳多樣性分析，這22個(gè)SSR標(biāo)記共擴(kuò)增了95個(gè)等位基因，每個(gè)基因座的等位基因數(shù)在2個(gè)或2個(gè)以上，平均一個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增出4.32個(gè)等位基因，PIC值的范圍在0.093到0.76之間。相

5、對(duì)谷子而言，微衛(wèi)星位點(diǎn)在谷子近緣野生種的變異性較強(qiáng)。聚類結(jié)果表明這些分子標(biāo)記能將谷子和雜草野生種明顯的區(qū)分開。同其野生祖先青狗尾草相比，栽培種谷子品種間的遺傳變異很??；金色狗尾草和S.palmifolia同谷子和青狗尾草等的遺傳分化很遠(yuǎn)；谷子、青狗尾草、法式狗尾草和S.leucopila等具有相對(duì)近的遺傳關(guān)系。這是首次利用SSR標(biāo)記分析谷子及其近緣種的遺傳關(guān)系和多樣性表現(xiàn)，結(jié)果符合已知的狗尾草屬系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。本研究利用5'錨定PCR技術(shù)