甲基對(duì)硫磷降解菌的篩選及其甲基對(duì)硫磷水解酶基因的克隆.pdf

1、有機(jī)磷農(nóng)藥作為一類高效廣譜的殺蟲(chóng)劑自從上世紀(jì)40年代發(fā)明以來(lái)，已在全世界范圍內(nèi)大面積使用。在半個(gè)多世紀(jì)里，這類殺蟲(chóng)劑增加了農(nóng)作物的產(chǎn)量，為人類社會(huì)的發(fā)展做出了重要的貢獻(xiàn)。但是隨著有機(jī)磷農(nóng)藥的長(zhǎng)期和大范圍使用，越來(lái)越多的環(huán)境問(wèn)題，人類健康問(wèn)題，人類可持續(xù)發(fā)展問(wèn)題開(kāi)始凸顯出來(lái)。有機(jī)磷降解酶可以破壞有機(jī)磷農(nóng)藥分子的磷脂鍵，最終使其脫毒。因此，通過(guò)基因工程技術(shù)生產(chǎn)高效、廉價(jià)具有廣譜特性的有機(jī)磷降解酶制劑是目前消除有機(jī)磷農(nóng)藥污染的最有潛力的方法。

2、 本研究從農(nóng)藥廠被農(nóng)藥長(zhǎng)期高度污染的土壤中通過(guò)富集培養(yǎng)分離得到一株能夠降解甲基對(duì)硫磷農(nóng)藥的細(xì)菌M231，經(jīng)過(guò)16SrDNA方法鑒定為蒼白桿菌(Ochrobactrum)，此菌能組成型分泌甲基對(duì)硫磷水解酶MPHXW。 通過(guò)保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，PCR擴(kuò)增得到該甲基對(duì)硫磷水解酶基因的部分片段。通過(guò)將已知序列在網(wǎng)上進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)而設(shè)計(jì)特異引物克隆得到甲基對(duì)硫磷水解酶基因mphxw全長(zhǎng)。編碼基因全長(zhǎng)993bp，(G+C)含量為67.

3、27％，具有一個(gè)開(kāi)放讀碼框，編碼330個(gè)氨基酸，其中前35個(gè)氨基酸殘基為信號(hào)肽序列，蛋白質(zhì)理論分子量為35kD。編碼基因的核苷酸序列分析表明，雖然該基因與目前發(fā)表的來(lái)源于蒼白桿菌Ochrobactrum的甲基對(duì)硫磷水解酶蛋白相似性達(dá)到98％，但比它們少一個(gè)氨基酸。同時(shí)該基因與本實(shí)驗(yàn)室先前報(bào)道的OPHC2相似性非常低，只有43.7％。mphxw已經(jīng)在GenBank中登錄，登錄號(hào)是EU596456。 將不帶有信號(hào)肽的編碼序列分別構(gòu)建

4、了原核表達(dá)重組載體pET-mphxw和真核表達(dá)重組載體pPIC9γ-mphxw，原核表達(dá)產(chǎn)物具有正常生物學(xué)功能。同時(shí)也篩選到了一批能夠分泌表達(dá)甲基對(duì)硫磷水解酶真核重組子。 從原菌Ochrobactrumsp.M231和原核表達(dá)重組子中純化了該基因的原菌蛋白和原核重組蛋白，對(duì)純化的原菌蛋白進(jìn)行了質(zhì)譜分析表明，分離純化的原菌蛋白和從該菌中克隆得到基因表達(dá)蛋白的序列是一致的。對(duì)原菌蛋白和原核重組蛋白的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在最適反應(yīng)