表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶的解脂耶羅威亞酵母工程菌的構(gòu)建及全細(xì)胞酶固定化研究.pdf

1、本文利用表面展示質(zhì)粒 pINA1317-YICPW110將來(lái)源于假單胞菌(Pseudomonas sp.)WBC-3的甲基對(duì)硫磷水解酶(methyl parathion hydrolase, MPH)展示在解脂耶羅威亞酵母(Yarrowia lipolytica)Po1h細(xì)胞表面，研究了重組工程菌的催化特性和降解性能。該工程菌安全無(wú)害、不攜帶抗性基因、目的基因表達(dá)無(wú)需誘導(dǎo)且可穩(wěn)定遺傳，而且避免了采用非表面展示重組工程菌進(jìn)行甲基對(duì)硫磷降解

2、時(shí)需要破碎細(xì)胞、酶純化時(shí)活性降低、酶與底物接觸不充分等問(wèn)題；為進(jìn)一步提高全細(xì)胞酶的重復(fù)使用性和連續(xù)操作的穩(wěn)定性，通過(guò)將綠色木霉(Trichoderma Viride)內(nèi)切葡聚糖酶IV(EG IV)的纖維素結(jié)合域(cellulose binding domain, CBD)與甲基對(duì)硫磷水解酶的融合蛋白展示在Y. lipolytica Po1h細(xì)胞表面，構(gòu)建了可特異吸附于纖維素基質(zhì)上的全細(xì)胞甲基對(duì)硫磷水解酶，采用固定化全細(xì)胞酶對(duì)甲基對(duì)硫磷進(jìn)

3、行降解研究，解決了甲基對(duì)硫磷水解酶采用常規(guī)固定化方法出現(xiàn)的活力下降、操作繁瑣、費(fèi)用昂貴等問(wèn)題。本文構(gòu)建了一種操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定高效、安全無(wú)害的固定化全細(xì)胞甲基對(duì)硫磷水解酶，開(kāi)辟了國(guó)內(nèi)甲基對(duì)硫磷降解的新思路和新手段，為甲基對(duì)硫磷降解提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐。主要研究結(jié)果如下：
　　(1)利用表面展示質(zhì)粒pINA1317-YlCWP110將Pseudomonas sp.WBC-3的甲基對(duì)硫磷水解酶在Y. lipolytica Po1h上進(jìn)

4、行了表面展示，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)和蛋白酶敏感性分析確定甲基對(duì)硫磷水解酶已成功展示于Y. lipolytica Po1h細(xì)胞表面。篩選得到甲基對(duì)硫磷水解酶酶活力最高的轉(zhuǎn)化子Z51，其甲基對(duì)硫磷水解酶比酶活力為36.5±0.5 U/mg cells(450.6±7.3 U/mL cell suspension)，酶活力優(yōu)于已有的多種重組表達(dá)的甲基對(duì)硫磷水解酶活力。
　　(2)表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶的最適作用pH為9.5，在pH4.0-

5、11.5之間較穩(wěn)定；最適作用溫度為40℃，在40℃以下穩(wěn)定性較好。Co2+、Mn2+、Ni2+、Cu2+對(duì)表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶活性有激活作用，Ag+、Li+、Ba2+、Hg2+對(duì)展示酶活力有抑制作用，K+、Zn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+、Na+對(duì)展示酶活力沒(méi)有明顯的影響。在10.0mL反應(yīng)體中的最佳水解條件為100mg/L甲基對(duì)硫磷、2.6×107 cells/ml表面展示甲基對(duì)硫磷水解酶的酵母細(xì)胞、反應(yīng)時(shí)間30

6、min，甲基對(duì)硫磷水解率可達(dá)90.8％。全細(xì)胞酶終濃度為2×107 cells/ml、甲基對(duì)硫磷濃度為20.0 mg/L的不同水體40℃、180 rpm振蕩反應(yīng)40 min，甲基對(duì)硫磷的降解率依次為淡水(pH9.5)98.7%、淡水(pH6.8)97.0%、海水(pH9.5)96.5%和海水(pH8.2)94.4%，全細(xì)胞酶重復(fù)使用4次后，仍可保持70%以上的活力。全細(xì)胞酶在4℃放置30天，仍能保持94%的活性。
　　(3)采用重

7、疊延伸PCR技術(shù)，構(gòu)建綠色木霉EG IV的CBD和Pseudomonas sp.WBC-3 MPH的融合基因片段，利用表面展示質(zhì)粒pINA1317-YlCWP110將MPH-CBD融合蛋白在Y. lipolytica Po1h酵母上進(jìn)行了表面展示，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)和蛋白酶敏感性分析確定MPH-CBD融合蛋白已成功展示于Y. lipolytica Po1h細(xì)胞表面。篩選得到甲基對(duì)硫磷水解酶酶活力最高的轉(zhuǎn)化子M3，其甲基對(duì)硫磷水解酶比酶活力

8、為33.1±1.1 U/mg cells(381.0±9.2 U/mL cell suspension)，甲基對(duì)硫磷水解酶的活性基本未受到CBD的影響。
　　(4)表面展示MPH-CBD融合蛋白的轉(zhuǎn)化子M3細(xì)胞吸附纖維素基質(zhì)的最適pH為8.0，最適溫度為4℃，在4℃-40℃之間具有良好的吸附性。M3細(xì)胞通過(guò)表面展示的MPH-CBD融合蛋白對(duì)纖維素基質(zhì)具有較高的吸附能力，且細(xì)胞與纖維素基質(zhì)的的結(jié)合非常牢固。將M3細(xì)胞固定于微晶纖維素