產(chǎn)β-胡蘿卜素耶氏解脂酵母工程菌的構(gòu)建.pdf

1、以耶氏解脂酵母菌（Yarrowia lipolytica）MYA2613為底盤菌，表達(dá)來源于卷枝毛霉菌（Mucor circinelloides）的基因carB，carRP后能有效生產(chǎn)β-胡蘿卜素。本研究旨在通過調(diào)控耶氏解脂酵母工程菌內(nèi)β-胡蘿卜素合成代謝途徑，來提高β-胡蘿卜素的產(chǎn)量，主要包括以下內(nèi)容：
　　1.為了優(yōu)化基因GGS1，carB，carRP的表達(dá)強(qiáng)度組合，將上述3個(gè)基因、終止子與兩組不同的啟動(dòng)子通過 DNA ass

2、emble方法拼接后，得到了兩個(gè)組合TEF1p-GGS1-xpr2t-GPD1p-carB-mig1t-EXP1p-carRP-lip2t和YAT1p-GGS1-xpr2t-GPD1p-carB-mig1t-FBAin1p-carRP-lip2t。轉(zhuǎn)入酵母后經(jīng)發(fā)酵表型驗(yàn)證，兩株菌都產(chǎn)β-胡蘿卜素，其中前者的產(chǎn)量是后者的4.18倍，有著明顯的優(yōu)勢(shì)。
　　2.嘗試在耶氏解脂酵母內(nèi)過表達(dá)來源于裂殖弧菌（Schizochytriμm）的基

3、因DD253524，該基因編碼的β-胡蘿卜素合酶同時(shí)具備著六氫番茄紅素合酶、六氫番茄紅素脫氫酶、番茄紅素環(huán)化酶這三種酶的功能域。將基因DD253524和GGS1在耶氏解脂酵母野生株MYA2613中共表達(dá)后，將驗(yàn)證結(jié)果為陽性的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行發(fā)酵表型驗(yàn)證，工程菌的β-胡蘿卜素產(chǎn)量約為3~10μg/g DCW。
　　3.考慮增加產(chǎn)β-胡蘿卜素工程菌的乙酰輔酶A供應(yīng)來提高β-胡蘿卜素的產(chǎn)量。為此我們?cè)O(shè)想了兩個(gè)方案，一個(gè)方案是乙醇補(bǔ)料發(fā)酵，乙醇

4、在酵母內(nèi)有著乙醇→乙醛→乙酸→乙酰輔酶 A的代謝路線，可以試圖補(bǔ)加乙醇來增加途徑中的乙酰輔酶A的供應(yīng)量。另一個(gè)方案是嘗試過表達(dá)家鼠源的ACL基因，ACL編碼ATP-依賴的檸檬酸裂解酶增加了檸檬酸的回用，使其生成乙酰輔酶A。經(jīng)發(fā)酵驗(yàn)證，通過提高乙酰輔酶A的供應(yīng)對(duì)提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響不大。
　　4.性別不同的耶氏解脂酵母可以發(fā)生接合，有報(bào)道表明雙倍體的酵母的大小和生長速率要優(yōu)于單倍體酵母。我們構(gòu)建了兩個(gè)質(zhì)粒，一個(gè)matB敲入質(zhì)粒