代謝工程改造釀酒酵母生物合成類胡蘿卜素的研究.pdf

1、釀酒酵母是異源合成天然產(chǎn)物的重要宿主，但是在釀酒酵母中構(gòu)建遺傳穩(wěn)定性好、基因表達(dá)可控的代謝途徑仍然是代謝工程和合成生物學(xué)中的一大挑戰(zhàn)。類胡蘿卜素是具有抗氧化、防癌等功效的高附加值四萜類化合物。本文以開發(fā)代謝途徑組裝工具和策略為基礎(chǔ)，結(jié)合代謝途徑基因的表達(dá)調(diào)控，關(guān)鍵酶的定向進(jìn)化等技術(shù)，對在釀酒酵母中構(gòu)建高效的β-胡蘿卜素和番茄紅素生物合成途徑進(jìn)行了研究。
　　首先，從紅法夫酵母cDNA中克隆了CrtE、Crt YB和CrtI三個(gè)基因

2、，并將其按照傳統(tǒng)的代謝途徑方法在高拷貝的2μ附著型載體上進(jìn)行了表達(dá)，獲得了能合成β-胡蘿卜素的重組菌株。由于該方法構(gòu)建的菌株遺傳不穩(wěn)定，我們探索了其它策略，以實(shí)現(xiàn)代謝途徑在基因組中的組裝。
　　為了能將長的代謝途徑有效地整合進(jìn)釀酒酵母的基因組中，研究中構(gòu)建了一套基于Cre/loxP重組系統(tǒng)的pMRI載體。經(jīng)過測試，該套載體在循環(huán)使用時(shí)其選擇標(biāo)記區(qū)段lox P-KanMX-p BR322ori-loxP的pop-out效率達(dá)到70％

3、，可以有效地用于代謝途徑中相關(guān)基因的分步整合?；谒鶚?gòu)建的載體工具，我們提出了代謝途徑的分散式整合策略（Decentralized assembly）。同時(shí)為了使所構(gòu)建的代謝途徑中的基因表達(dá)可以受到外部條件控制，對釀酒酵母的GAL調(diào)控系統(tǒng)進(jìn)行了改造，敲除了其中的GAL80基因，使GAL啟動(dòng)子所控制的基因表達(dá)可以受到外界葡萄糖濃度的調(diào)控。將兩個(gè)拷貝的Crt YB和CrtI以及一個(gè)拷貝的CrtE和tHMG1，共6個(gè)ORF整合到酵母基因組中，

4、并利用改造后的GAL調(diào)控系統(tǒng)對上述基因的表達(dá)進(jìn)行控制，所得到的重組釀酒酵母菌株在搖瓶中的總類胡蘿卜素產(chǎn)量達(dá)到了11 mg/g DCW(72.57mg/L)。通過20代的連續(xù)培養(yǎng)，證實(shí)了所構(gòu)建代謝途徑的遺傳穩(wěn)定性。
　　代謝前體物質(zhì)的平衡利用是提高目標(biāo)代謝物產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。通過建立以類胡蘿卜素顏色為指示的啟動(dòng)子強(qiáng)度表征系統(tǒng)，對一系列不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子進(jìn)行了篩選，其中強(qiáng)啟動(dòng)子被用于基因的過表達(dá)，而弱啟動(dòng)子則用于旁側(cè)代謝途徑的下調(diào)。結(jié)合組

5、成型和誘導(dǎo)型β-胡蘿卜素合成途徑以及HXT1啟動(dòng)子控制的角鯊烯合成途徑，對節(jié)點(diǎn)物質(zhì)FPP的上游、下游和旁側(cè)基因的表達(dá)進(jìn)行了順序控制。通過上述策略構(gòu)建出了總類胡蘿卜素產(chǎn)量高達(dá)20.79mg/g DCW(1156mg/L)的釀酒酵母菌株。該菌株與實(shí)驗(yàn)中最初構(gòu)建的僅僅整合了Crt YB和CrtI基因的菌株相比，其單位細(xì)胞干重中總類胡蘿卜素的產(chǎn)量提高了約700倍。同時(shí)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR證實(shí)了在發(fā)酵過程中代謝途徑中各基因的表達(dá)是以預(yù)期的順序進(jìn)行

6、。
　　此外，為了構(gòu)建能高效合成番茄紅素的菌株，研究中采用定向進(jìn)化的方法對合成途徑中的關(guān)鍵酶進(jìn)行了逐個(gè)改造。其中，通過對CrtYB基因編碼的雙功能酶的環(huán)化酶功能區(qū)域進(jìn)行定向進(jìn)化，得到了環(huán)化酶失活，但八氫番茄紅素合酶功能域保留完好的突變體CrtYB11M;對CrtE基因定向進(jìn)化得到了表達(dá)量提高的正突變CrtE03M。與野生型相比，突變體CrtE03M在基因組上的表達(dá)使得番茄紅素的產(chǎn)量提高了1.16倍。然后，通過調(diào)節(jié)不同Crt基因的拷