丙酮酸羧化酶在海洋解脂耶羅威亞酵母菌合成檸檬酸中的作用.pdf

1、檸檬酸是一種重要的有機酸，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥與工業(yè)領(lǐng)域。目前檸檬酸主要是通過生物發(fā)酵的方式獲得，其中黑曲霉是工業(yè)發(fā)酵的主要菌株。然而，黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的廢物易污染環(huán)境，并且發(fā)酵控制技術(shù)要求高，對菌株的遺傳改造難度也大。在檸檬酸的發(fā)酵生產(chǎn)中，解脂耶羅威亞酵母菌能夠克服黑曲霉生產(chǎn)中的不足，已經(jīng)成為近年來研究的熱點，作為檸檬酸工業(yè)生產(chǎn)菌株也逐漸被人們所認同。
　　在其他人的研究中發(fā)現(xiàn)，丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylas

2、e)在有機酸合成方面有著很大的作用。該酶催化丙酮酸形成草酰乙酸，在酵母油脂合成與琥珀酸、α-酮戊二酸以及蘋果酸等有機酸積累方面有著重要作用。檸檬酸是草酰乙酸與乙酰CoA通過縮合作用形成的，因此我們認為丙酮酸羧化酶在檸檬酸合成中也起著某些重要作用。為了進一步研究丙酮酸羧化酶在檸檬酸合成調(diào)控中的作用，本論文分別克隆了季也蒙畢赤酵母（Pichia guilliermondii）Pcla22菌株和海洋霉菌產(chǎn)紅青霉（Penicillium rub

3、ens）I067菌株的丙酮酸羧化酶基因，并將這些基因在解脂耶羅威亞酵母（Yarrowia lipolytica）SWJ-1b菌株中進行了表達。
　　pINA1312質(zhì)粒是適用于在解脂耶羅威亞酵母（Y.lipolytica）中高效表達外源基因的質(zhì)粒。但在實際應(yīng)用中，該質(zhì)粒由于多克隆位點區(qū)域可用的酶切位點過少，在表達外源基因的過程中受到了很大的限制。本研究采用引物人工退火與酶切連接的方法，成功構(gòu)建pINA1312-GY質(zhì)粒，在pINA

4、1312質(zhì)粒上增加3個新的酶切位點，為外源基因在Y.lipolytica中表達構(gòu)建了方便有效的工具。
　　季也蒙畢赤酵母（P.guilliermondii）是一株已全基因組測序的菌株，具有遺傳背景清楚和高產(chǎn)有機酸的優(yōu)點。將一株分離自海洋的季也蒙畢赤酵母Pcla22菌株的丙酮酸羧化酶基因(PYC)在解脂耶羅威亞酵母SWJ-1b菌株中進行了表達。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化子PG86的丙酮酸羧化酶酶活和檸檬酸產(chǎn)量都明顯高于原始菌株SWJ-1b。在補

5、料發(fā)酵條件下，轉(zhuǎn)化子PG86的發(fā)酵液檸檬酸濃度為101.0±1.3g/l，糖轉(zhuǎn)化為檸檬酸的得率為0.89 g/g。HPLC檢測表明發(fā)酵產(chǎn)物主要為檸檬酸。這表明丙酮酸羧化酶基因(PYC)得到了超表達，且該酶在檸檬酸合成調(diào)控中具有重要作用，超表達丙酮酸羧化酶可以促進檸檬酸的累積。
　　海洋霉菌產(chǎn)紅青霉（P.rubens）是一株高產(chǎn)有機酸的菌株，目前對它的研究還很少。本實驗采用簡并引物和基因組步移的方法，克隆了產(chǎn)紅青霉（P.rubens

6、）I067菌株的丙酮酸羧化酶基因及其上下游調(diào)控區(qū)基因。該菌丙酮酸羧化酶基因（登錄號:KM397349.1）ORF框共3534 bp，編碼1177個氮基酸，預(yù)測的蛋白質(zhì)分子量為127.531 kDa，等電點pI6.20。啟動子位于基因上游-1200bp位置，包含一個TATAA框、多個CAAT框和5'-SYGGRG-3'序列。該酶無信號肽，為同源四聚體結(jié)構(gòu)(α4)，每一單體包含四個功能區(qū)域。
　　為了進一步提高檸檬酸產(chǎn)量，將1607菌

7、株的丙酮酸羧化酶基因(RPYC)在解脂耶羅威亞酵母SWJ-1b菌株中進行表達。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化子PR32的丙酮酸羧化酶酶活可達0.53 U/mg，高于相同條件下SWJ-1b菌株和PG86菌株的酶活（分別為0.07 U/mg和0.38 U/mg）。測定了補料發(fā)酵條件下轉(zhuǎn)化子PR32菌株的產(chǎn)檸檬酸能力，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液中檸檬酸濃度為111.1±1.3g/l，糖轉(zhuǎn)化為檸檬酸的得率為0.93 g/g。進一步表明，提高丙酮酸羧化酶酶活力，可以將更多的C