檸檬酸合成酶基因與磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因轉(zhuǎn)化苜蓿的研究.pdf

1、紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是世界栽培歷史最悠久、面積最大、利用最廣泛的一種豆科牧草，被譽為“牧草之王”。在我國北方有大面積種植，而南方酸性土壤中鋁毒的存在限制了苜蓿在該地區(qū)的推廣，因而培育對鋁耐受力強的苜蓿新品種是解決苜蓿在南方種植的重要措施。近年來，隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展及對植物耐鋁機制研究的不斷深入，為我們使用分子手段培育耐鋁苜蓿新品種奠定了基礎(chǔ)。
　　 本研究以渝苜一號紫花苜蓿的15號植株和以此植

2、株為材料轉(zhuǎn)化了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的P-83號植株為材料。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤法，將檸檬酸合成酶(CS)基因分別轉(zhuǎn)入這兩種材料中，并對轉(zhuǎn)化了CS基因植株、PEPC基因植株、CS-PEPC雙基因植株進行PCR及RT-PCR檢測，鑒定目的基因的整合與轉(zhuǎn)錄表達情況，然后進行酶活測定，有機酸含量測定，有機酸分泌量測定及耐鋁試驗。
　　 本研究目前取得的主要研究結(jié)果如下：
　　 1通過遺傳轉(zhuǎn)化得到29個抗性植株，這

3、些植株經(jīng)過PCR檢測得到6株轉(zhuǎn)基因苗，其中C-P-2、C-P-6、C-P-11、C-P-19為轉(zhuǎn)化CS-PEPC雙基因植株，CS-4、CS-9為轉(zhuǎn)化CS單基因植株。將經(jīng)過PCR鑒定的6株轉(zhuǎn)基因植株用RT-PCR檢測顯示均能在轉(zhuǎn)錄水平上表達，CS基因轉(zhuǎn)錄表達最強的是轉(zhuǎn)雙基因植株C-P-11和C-P-2，而PEPC基因表達最強的是轉(zhuǎn)PEPC單基因植株P(guān)-83。
　　 2測定了不同轉(zhuǎn)基因植株葉片CS活性及PEPC活性，結(jié)果顯示：各類植

4、株CS酶活性水平從高到低依次是轉(zhuǎn)CS-PEPC雙基因植株、轉(zhuǎn)CS單基因植株和野生株，其中轉(zhuǎn)CS-PEPC雙基因植株C-P-2的CS活性最高，達0.0225μmol NADH/min/mg protein，約為野生株的2.6倍；各類植株P(guān)EPC活性水平從高到低依次是轉(zhuǎn)PEPC單基因植株、轉(zhuǎn)CS-PEPC雙基因植株和野生株，其中轉(zhuǎn)PEPC單基因植株P(guān)-83的PEPC活性最高，達0.049μmolNAD/min/mg protein，約是野生

5、株的2倍，其次為轉(zhuǎn)CS-PEPC雙基因植株C-P-2，PEPC活性達0.0442μmolNAD/min/mg protein。
　　 3測定了不同轉(zhuǎn)基因植株葉片和根尖有機酸含量，結(jié)果顯示：對于葉片草酸含量、蘋果酸含量和檸檬酸含量，與野生株相比，轉(zhuǎn)基因植株有顯著增加，而且轉(zhuǎn)CS-PEPC雙基因植株高于轉(zhuǎn)CS單基因植株，轉(zhuǎn)CS單基因植株高于轉(zhuǎn)PEPC單基因植株；對于根尖草酸含量，轉(zhuǎn)CS-PEPC雙基因植株和轉(zhuǎn)CS單基因植株根尖草酸含

6、量高于轉(zhuǎn)PEPC單基因植株和野生株，CS-PEPC雙基因植株、CS單基因植株和PEPC單基因植株三者對提高根尖蘋果酸和檸檬酸含量無顯著差異，但均顯著高于野生株。
　　 4測定了根系有機酸分泌量，結(jié)果顯示，當(dāng)無鋁處理時，各轉(zhuǎn)基因植株根系有機酸分泌量無顯著差異。當(dāng)植株受鋁脅迫時，各轉(zhuǎn)基因植株之間的草酸分泌量無顯著性差異，但均顯著高于野生株；蘋果酸分泌量從多到少的分別是轉(zhuǎn)PEPC單基因植株、轉(zhuǎn)CS單基因植株和轉(zhuǎn)CS-PEPC雙基因植株

7、；檸檬酸分泌量則是轉(zhuǎn)CS-PEPC雙基因植株比轉(zhuǎn)CS單基因植株多，轉(zhuǎn)PEPC單基因植株未被測出檸檬酸分泌。在受到鋁毒害時，野生株也沒有被測出蘋果酸和檸檬酸的分泌。
　　 5耐鋁性試驗結(jié)果表明：當(dāng)無鋁處理時，各植株根伸長正常，伸長量無顯著性差異，根尖不能被鉻天青染色。當(dāng)植株受鋁脅迫時，各類植株根伸長量從長到短依次是轉(zhuǎn)CS-PEPC雙基因植株、轉(zhuǎn)PEPC單基因植株和轉(zhuǎn)CS單基因植株；根尖染色程度即根尖受害程度從大到小依次是轉(zhuǎn)CS單基

8、因植株、轉(zhuǎn)PEPC單基因植株和轉(zhuǎn)CS-PEPC雙基因植株，其中轉(zhuǎn)雙基因植株C-P-2在20μM鋁脅迫時根尖未見到受害。
　　 本試驗的結(jié)論：PCR檢測證明CS基因和PEPC基因能整合到紫花苜?；蚪M中，RT-PCR鑒定表明CS基因和PEPC基因均能有效在轉(zhuǎn)基因苜蓿植株中表達，提高了相關(guān)酶的活性，增加了葉片和根尖的有機酸含量，增強根系有機酸的分泌量，從而提高了對鋁的耐受能力。各類植株耐鋁能力從強到弱依次是轉(zhuǎn)CS-PEPC雙基因植株