不同真菌來源的ATP-檸檬酸裂解酶基因的克隆與表達.pdf

1、ATP-檸檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase,ACL,EC2.3.3.8)是脂肪酸合成途徑外的一個關鍵酶,它能催化檸檬酸裂解成草酰乙酸和乙酰輔酶A。ACL的存在是微生物油脂積累的一個先決條件,本研究利用基因組步移法和常規(guī)PCR法從5種不同的真菌:粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)、斯達酵母(Lipomyces starkeyi)、高山被孢霉(Mortieralla alpine)、米曲霉(Aspergill

2、us oryzae)和核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)中分別克隆得到了acl基因,并分別在大腸桿菌和畢赤酵母中進行了異源表達,然后通過紫外分光光度計法測定酶活和氣相色譜分析測定脂肪酸含量的方法來對表達產(chǎn)物進行功能驗證。主要結果如下:
　　 (1)成功克隆得到了5種真菌來源的acl基因,其中利用基因組步移法克隆得到了在GenBank中未登錄的粘紅酵母和斯達酵母的acl基因編碼序列,且這兩種菌的acl基因序

3、列完全一致,包含有兩個亞基acl1(1953 bp)和acl2(1494 bp)。
　　 (2)成功將5種真菌來源的acl基因在大腸桿菌Rosetta-gami(DE3)進行了誘導表達,SDS-PAGE檢測表明粘紅酵母、斯達酵母、米曲霉和核盤菌的來源的acl基因表達后的ACL1和ACL2亞基的分子量大小都相似,分別約為66 kDa和55 kDa,高山被孢霉來源的acl基因表達后的ACL蛋白分子量大小約為120 kDa。
　

4、　 (3)對所有大腸桿菌表達后的ACL蛋白酶活力進行了測定,結果表明粘紅酵母、斯達酵母的acl基因表達后具有最高的酶活力(4.2 U/mg),且只有當ACL1和ACL2亞基都具備,摩爾比為1:1時才能使全酶的酶活力達到最大。
　　 (4)將粘紅酵母acl1和acl2基因在大腸桿菌Rosetta-gami(DE3)中進行共表達,氣相色譜分析脂肪酸含量,結果表明重組菌株在誘導表達12 h時脂肪酸含量達到最大,為8.2％,較對照菌株

5、的提高量也達到最大的24.8％,提高效果十分顯著。
　　 (5)對粘紅酵母acl1和acl2基因在畢赤酵母GS115進行表達研究,結果表明表達后全酶的酶活力為6.5 U/mg,較原核表達的酶活力提高了近55％,并確定了酶催化反應的最佳條件為:pH8.5,37℃反應10 min。
　　 本研究表明粘紅酵母和斯達酵母等油脂酵母類的acl基因可以利用基因工程手段對其表達量進行調控,提高ACL酶活力,增強脂肪酸的合成。因此,油脂