谷子和甘蔗C-,4-型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及其轉(zhuǎn)基因水稻光合效率的提高.pdf

1、水稻是我國(guó)重要的糧食作物之一，它是一種典型的C3植物。與其它C3作物不一樣的是，水稻的生長(zhǎng)需要相對(duì)較高的溫度和充足的陽(yáng)光照射。然而高溫和高光強(qiáng)的生長(zhǎng)環(huán)境更加適合于C4植物的生長(zhǎng)，更加有利于發(fā)揮C4植物高光合效率的特點(diǎn)。因此本論文希望將C4植物中固定CO2的酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因?qū)胨?，獲得一種更加適合高溫和高光強(qiáng)生活環(huán)境的“C4型”水稻，這對(duì)于提高水稻的產(chǎn)量，滿(mǎn)足人口增長(zhǎng)對(duì)糧食需求具有重大意義。
　　 本論文從C4植物谷

2、子和甘蔗中克隆了其C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶cDNA基因，獲得了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的基因克隆，并將它們導(dǎo)入粳稻品種中花8號(hào)，進(jìn)而對(duì)轉(zhuǎn)基因材料的光合生理特性進(jìn)行了研究。結(jié)果如下：
　　 首次從谷子中得到了ppc基因兩個(gè)cDNA克隆，分別命名為Mppc1和Mppc2。前者是一個(gè)C3型的ppc基因，它可能屬于在根中特異表達(dá)的C3-2型ppc基因；后者是在綠色葉片中大量表達(dá)的C4型ppc基因。它們所編碼的蛋白的氨基酸殘基數(shù)分別為961和

3、964，序列同源性為82.5％。C4型PEPC多出的3個(gè)氨基酸位于N末端。利用RACE的方法我們得到了谷子C4型ppc基因完整的cDNA序列，包括63bp的5'非編碼區(qū)，2895bp的編碼區(qū)和256bp的3'非編碼區(qū)。
　　 首次獲得了甘蔗C4型ppc基因完整的cDNA序列的克隆，命名為Sppc。它包括95bp的5’非編碼區(qū)、2886bp的編碼區(qū)，和224bp的3'非編碼區(qū)。
　　 利用所克隆的基因，分別連上強(qiáng)組成型啟動(dòng)

4、子Ubiquitin啟動(dòng)子和強(qiáng)光調(diào)控啟動(dòng)子Rubisco小亞基啟動(dòng)子后，再插入兩個(gè)標(biāo)記基因不同的表達(dá)載體pCB和pPCB的多克隆位點(diǎn)中，構(gòu)建了八個(gè)含有外源ppc基因的植物表達(dá)載體pCB-Pubi-Mppc、pCB-Pubi-Sppc、pCB-PrbcS-Mppc、pCB-PrbcS-Sppc、pPCB-Pubi-Mppc、pPCB-Pubi-Sppc、pPCB-PrbcS-Mppc和pPCB-PrbcS-Sppc。再加上含有玉米完整的C

5、4型ppc核基因的載體pCB-ZMppc，共有9個(gè)載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行了水稻的轉(zhuǎn)化，各個(gè)載體都獲得了大量的轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)標(biāo)記基因潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因hpt和磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因pmi以及導(dǎo)入的目的ppc基因的PCR擴(kuò)增檢測(cè)，結(jié)果顯示絕大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植株都能擴(kuò)增出目的片段，而未轉(zhuǎn)化的植株則沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物。對(duì)部分轉(zhuǎn)基因水稻的Southern和Western雜交以及RT-PCR分析都表明，無(wú)論從DNA水平、mRNA水平，還是從蛋白質(zhì)水平上都

6、證明外源ppc基因都成功地導(dǎo)入了水稻，并獲得了正確的表達(dá)。
　　 對(duì)各載體轉(zhuǎn)基因植株P(guān)EPC活性大規(guī)模的測(cè)定表明，轉(zhuǎn)入玉米完整C4型PEPC核基因(有內(nèi)含子)的水稻表現(xiàn)出極大的表達(dá)效率，大多數(shù)轉(zhuǎn)基因材料的PEPC活性為對(duì)照的10-20倍，其活性最高可達(dá)到對(duì)照的44倍。轉(zhuǎn)入谷子和甘蔗PEPC基因cDNA的水稻，表達(dá)的效率很低，多數(shù)材料活性增加僅為對(duì)照的2-5倍，但也有極少數(shù)材料活性增加了10倍以上。用Rubisco小亞基啟動(dòng)子控制

7、的ppc基因在水稻的表達(dá)活性要略高于Ubiquitin啟動(dòng)子控制的ppc基因。以上結(jié)果說(shuō)明ppc基因的內(nèi)含子在其轉(zhuǎn)錄或mRNA的穩(wěn)定上起著重要作用。
　　 對(duì)部分轉(zhuǎn)基因材料氣體交換特征的研究發(fā)現(xiàn)，隨著轉(zhuǎn)基因水稻PEPC活性的增加，凈光合速率也有逐漸增加的趨勢(shì)。其中PEPC活性最大的ZM24株系的三個(gè)單株凈光合速率比對(duì)照增加了39.8％、13.7％和28.6％，而它們的PEPC活性比對(duì)照分別增加了21.2、21.9和23.6倍。<