瓜蔞(Trichosanthes kirilowii)纖溶酶的分離純化與性質(zhì)分析.pdf

1、血栓性疾病嚴(yán)重危害人類的健康和生命，研制開發(fā)特異、高效、安全的溶血栓藥物，成為近年來生命科學(xué)的熱門課題之一。研究證明，活血化瘀中草藥可以改善血流動力、血流變和微循環(huán)，對于血栓性疾病有良好的治療效果。本實(shí)驗(yàn)室前期工作表明，中草藥瓜蔞（Trichosanthes kirilowii）具有顯著的體外溶解纖維蛋白的活性，因此，本研究在此基礎(chǔ)上從瓜蔞中分離純化體外具有高纖溶活性的蛋白酶，并對其性質(zhì)進(jìn)行研究。
　　 利用硫酸銨沉淀法和等電點(diǎn)

2、沉降法得到瓜蔞蛋白提取物。通過親和層析（環(huán)氧氯丙烷活化法制備以大豆胰蛋白酶抑制劑為配基的Sepharose4B親和層析載體）、離子交換層析等方法從瓜蔞蛋白提取物中分離得到了兩個具有纖溶活性、表觀分子量分別為66.0kD和55.6 kD的蛋白酶組分；經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)PVDF膜，對55.6 kD的蛋白酶N端氨基酸進(jìn)行測序，得到N端10個氨基酸序列為N-DVRSPRDTDE，經(jīng)NCBI比對結(jié)果表明，與其他生物來源的纖溶酶序列相似性均低3

3、0％，是一種新型纖溶酶，命名為TkFE。
　　 蛋白酶抑制劑結(jié)果表明該蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶類；它的pI為9.5；相當(dāng)于胰蛋白酶活性為2.47U·mg-1； pH穩(wěn)定性良好，最適pH為9.0；4-40℃保持最高活力，活性穩(wěn)定；Ag+完全抑制TkFE的活性，Cu2+部分抑制TkFE活性，剩余活性為72.25％，Mg2+、Mn2+、Na+、K+對TkFE的活性均有一定的激活作用；在以酪蛋白為底物的水解反應(yīng)中，溫度、酶底物比、pH、反