溶栓新藥瑞替普酶（Reteplase）變復(fù)性及分離純化的研究.pdf

1、瑞替普酶(Reteplase)是第三代溶血栓藥物，該產(chǎn)品在臨床上更具有藥物半衰期長(zhǎng)、溶栓作用強(qiáng)、副作用小等優(yōu)點(diǎn)。Reteplase是組織型纖溶酶原激活劑的衍生體，在原分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了功能域的刪除，保留了kringle II，蛋白酶兩個(gè)功能域及N端的3個(gè)氨基酸。該重組突變體是單鏈非糖基化蛋白，由355個(gè)氨基酸組成，分子量約為39kD，含有9對(duì)二硫鍵。 選用E.coli作為表達(dá)系統(tǒng)，目的蛋白能夠在很短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)高水平表達(dá)，

2、但表達(dá)產(chǎn)物在胞內(nèi)以無(wú)活性的聚集物一包涵體的形式存在。首先高密度發(fā)酵重組E.coli工程菌生產(chǎn)包涵體，其中IPTG的誘導(dǎo)是關(guān)鍵的一步。誘導(dǎo)條件的優(yōu)化既可以誘導(dǎo)蛋白最大限度的表達(dá)，又避免了過(guò)高的IPTG的濃度對(duì)工程菌的毒害作用。在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)重組蛋白時(shí)，這些重組蛋白質(zhì)會(huì)在細(xì)胞內(nèi)凝集，形成無(wú)活性的包涵體顆粒。超聲裂解離心后得到的包涵體除含有目的蛋白外，還有一些核酸，雜蛋白和膜蛋白，包涵體的純度直接影響到后續(xù)變性與復(fù)性的效果，因此要獲得

3、純化的有活性的Reteplase，首先要提取和純化包涵體。低濃度的變性劑例如尿素可以除去包涵體上的一些膜蛋白等雜質(zhì)，但是純化程度還是有一定的限制，應(yīng)用鹽沈一尿素洗一水洗三次連續(xù)的洗滌純化方法能在相當(dāng)程度上提高包涵體的純度，變性效果也有所提高。 變性的目的是將致密的包涵體打開(kāi)，使沒(méi)有生物學(xué)活性的Reteplase轉(zhuǎn)為具有活性的蛋白質(zhì)，以提高重組蛋白的復(fù)性率，降低生產(chǎn)成本。由于Reteplase分子中的l8個(gè)cys要形成9對(duì)

4、二硫鍵，所以利用E.coli表達(dá)Reteplase時(shí)，往往會(huì)發(fā)生二硫鍵的錯(cuò)配，這也是包涵體形成的原因之一。所以溶解包涵體的時(shí)候要加入適當(dāng)?shù)淖冃砸阂源蚱扑械亩蜴I，不同的變性液對(duì)包涵體的溶解作用是不同的。經(jīng)試驗(yàn)比較，采用變性液(50 mmol/LTris，1mmol/L EDrrA，8 mol/L尿素，150 mmol/Lβ-巰基乙醇，pH 9.0)能使包涵體徹底溶解，有利于隨后的再折疊。影響重組蛋白復(fù)性的因素很多，根據(jù)Reteplas

5、e的特點(diǎn)，考慮了蛋白濃度，復(fù)性時(shí)間，復(fù)性溫度對(duì)復(fù)性效果的影響。我們采用稀釋復(fù)性法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，最適的復(fù)性液是0.1 mol/LTris，1mmol/LEDTA，1 mmol/LGSH，0.2mmol/L GSS G,0.5 mol/L L-Arg，pH=10.5，尿素的終濃度為1.5mol/L。稀釋后在室溫下靜置24h。 采用ETI親和層析法對(duì)復(fù)性后的Reteplase進(jìn)行純化，ETI是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑類(lèi)，而Retepl