豬囊尾蚴SLC10未知功能分子在畢赤酵母中的表達與定位研究.pdf

1、SLC10是以絳蟲保守的反式剪接引導序列為基礎，通過RT-PCR從豬囊尾蚴中克隆出來的一個未知基因。其ORF為507bp，編碼大小為18.2kD的蛋白，基因組全長1107bp，由兩個外顯子和一個內(nèi)含子組成。本試驗旨在選擇巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng) (Pichiapastoris Expression System) 在體外表達豬囊尾蚴SLC10蛋白，并進行組織定位，研究其在蟲體中的功能，挖掘其應用潛力，為更進一步分析該蛋白的生物學特性奠定基

2、礎。從豬囊尾蚴中提取總RNA，用DANStar軟件設計SLC10蛋白基因特異性引物，通過RT-PCR擴增出507bp的片段，擴增產(chǎn)物和真核表達載體pPIC9K分別用EcoR Ⅰ和NotⅠ酶切，將SLC10亞克隆至pPIC9K中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，篩選陽性克隆。用Sac Ⅰ內(nèi)切酶線性化重組質(zhì)粒 pPIC9K-SLC10，然后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母SMD1168。將所有在營養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基MD上生長出的轉(zhuǎn)化子，采用G418濃度梯度進行篩選，

3、獲得的高拷貝重組菌株，用PCR檢測表明有目的基因整合。用1﹪甲醇誘導表達重組菌株，通過SDS-PAGE、ELISA對表達產(chǎn)物進行分析。結(jié)果表明，SLC10蛋白基因在畢赤酵母中成功表達，表達產(chǎn)物的分子量為18ku左右，用親和層析純化的重組蛋白作為包被抗原進行ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)70份囊尾蚴陰性血清和75份囊尾蚴陽性血清都不與其發(fā)生反應，說明SLC10重組蛋白不能被人囊蟲陽性血清所識別，不具有免疫反應性。將純化的SLC10重組蛋白免疫家兔制