轉(zhuǎn)基因馬鈴薯表達(dá)體系中人白細(xì)胞介素-12的純化及生物學(xué)活性的鑒定.pdf

1、目的：利用本室培育的人白細(xì)胞介素-12(human interleukin 12，hIL-12)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯，探討hIL-12的純化工藝，并塒hIL-12的生物學(xué)活性進(jìn)行鑒定。 方法：液氮研磨轉(zhuǎn)基因馬鈴薯，加入蛋白提取液，離心，對(duì)上清液進(jìn)行超濾，濃縮液經(jīng)MKF-AIW陰離子交換層析、MKF-CIC陽(yáng)離子交換層析純化。在陰離子交換層析吸附過(guò)程中采用試管法選擇最佳吸附pH值，選擇洗脫過(guò)程最佳洗脫pH值；選擇陽(yáng)離子交換層析洗脫過(guò)程最佳

2、洗脫pH值：ELISA法測(cè)定各純化階段收集的上清液或洗脫峰中的hIL-12的含量；非還原SDS-PAGE電泳鑒定蛋白純度；Western Blot檢測(cè)純化的hIL-12；ELISA測(cè)定純化的hIL-12誘使外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)產(chǎn)生IEN-γ的量；MTT法檢測(cè)純化的hIL-12體外抗腫瘤作用。 結(jié)果：轉(zhuǎn)基因馬鈴薯經(jīng)粗提獲得提取液、超濾得到濃縮液，ELISA測(cè)定hIL-12的量，各為717.50±2.85 pg/ml、163

3、8.89±5.92 pg/ml(稀釋20倍)。陰離子交換層析吸附過(guò)程最佳吸附pH值為7.5，洗脫過(guò)程最佳洗脫pH值為7，陽(yáng)離子交換層析洗脫過(guò)程最佳洗脫pH值為6.5。濃縮液經(jīng)MKF-AIW陰離子交換層析，樣品出現(xiàn)4個(gè)洗脫峰，經(jīng)ELISA測(cè)定和非還原SDS-PAGE電泳結(jié)果分析，第三個(gè)峰為目的蛋白峰，收集體積為6ml，hIL-12的含量為725.09±5.49 pg/ml(稀釋20倍)，回收率為67.36％，蛋白純度為66％；樣品經(jīng)MKF

4、-ClC陽(yáng)離子交換層析后出現(xiàn)3個(gè)洗脫峰，經(jīng)ELISA測(cè)定和非還原SDS-PAGE電泳結(jié)果分析，第二個(gè)峰為目的蛋白峰，收集體積為8ml，hIL-12的含量為318.75±1.30 pg/ml(稀釋20倍)，回收率為39.49％，蛋白純度為91％。WesternBlot分析結(jié)果表明，在40KD處有特異的蛋白條帶出現(xiàn)。純化的hIL-12與重組人白介素-12(rhIL-12)在25～400pg/ml濃度范圍內(nèi)，在體外均能刺激PBM產(chǎn)生IFN-γ