人白細胞介素-21的基因克隆、表達及對NK92細胞生物學作用的初步研究.pdf

1、白細胞介素-21(IL-21)是2000年發(fā)現(xiàn)的由CD4+T細胞分泌的I型細胞因子。IL-21在其他細胞因子或刺激因子協(xié)同作用下能夠?qū)細胞、T細胞和NK細胞的生長以及功能效應(yīng)發(fā)揮廣泛的調(diào)節(jié)作用。成熟人IL-21相對分子質(zhì)量(Mr)是15000，由131個氨基酸形成四螺旋束狀結(jié)構(gòu)域，與IL-2、IL-4和IL-15具有同源性。其生物學效應(yīng)是通過I型細胞因子受體IL-21R(IL-21Ra)介導的，但是必須與共用受體γ鏈(γc)結(jié)合才能介

2、導完整的生物學效應(yīng)。γc也是IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15的共用受體。IL-2l主要來源于活化的CD4+T細胞。近期研究發(fā)現(xiàn)NKT細胞可能是潛在分泌IL-21的重要細胞，通過分泌IL-21介導對B、T、NK細胞和自身的免疫調(diào)節(jié)。 IL-21Ra是一種新的白細胞介素受體(NILR)，它包含四個保守的半胱氨酸殘基，一段Trp-Ser-X-Trp-Ser基序，一段IL-2Rβ鏈高度保守的氨基酸序列。同IL-2、IL

3、-4、IL-7、IL-9和IL-15相似，IL-21活化JAK家族蛋白酪氨酸激酶JAK-1和JAK-3，其中JAK-1結(jié)合IL-21R亞單位，JAK-3結(jié)合于共同丫鏈。與其他γc家族細胞因子不同的是，這兩個激酶主要介導IL-21依賴的STAT1和STAT3的活化，而不是STAT5A和STAT5B的活化。IL-21R通常廣泛表達于T細胞、B細胞、NK細胞和一些骨髓細胞及角化細胞表面。 研究表明IL-21對NK、T及B等各種免疫細胞

4、介導廣泛的生物學效應(yīng)。IL-21對B細胞的發(fā)育或者增殖的影響并不明顯，不起主要作用，甚至引起B(yǎng)細胞凋亡，但研究表明IL-21能促進B細胞類別轉(zhuǎn)換、漿細胞的分化并在不同的微環(huán)境下對B細胞功能產(chǎn)生不同的調(diào)節(jié)，表現(xiàn)為功能的多態(tài)性。IL-21和IL-4都作為免疫球蛋白(Ig)的廣泛調(diào)解因子共同調(diào)節(jié)IgG和IgE的類別轉(zhuǎn)換及Ig的合成。IL-21和IL-15協(xié)同誘導naive(CD44low)和memory(CD44hi)CD8+T細胞的增殖，增

5、加產(chǎn)生IFN-γ的CD8+T數(shù)量，誘導顆粒酶B基因的表達，這表明IL-21不僅能協(xié)同促進T細胞的克隆增殖還能增強T細胞的功能效應(yīng)。IL-21單獨不能使NK細胞增殖或存活，甚至會增加NK細胞凋亡率。低劑量的IL-21能夠協(xié)同IL-2或IL-15促進NK細胞的增殖，高劑量的IL-21卻抑制NK細胞的增殖，但這種抑制同時伴隨著向大顆粒淋巴細胞表型的轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生高水平的穿孔素和IFN-γ，增強NK細胞細胞毒活性?？紤]到IL-21對NK細胞功能的影

6、響時，往往離不開NK細胞表面受體方面的研究。NKG2D是NK細胞重要的活化性受體，曾有研究表明IL-21可以通過NKG2D機制增強腫瘤模型鼠的抗腫瘤效應(yīng)。但是也有文獻報道IL-21通過負調(diào)節(jié)接頭分子DAP10的基因表達而下調(diào)人primaryNK和CD8+T細胞表面NKG2D/DAP10的表達，從而抑制primaryNK細胞通過NKG2D介導的細胞毒作用。這可能是由種屬差異造成的。 本實驗擬通過構(gòu)建含IL-21基因的原核表達載體，

7、優(yōu)化rhIL-21的表達條件；探索rhIL-21包涵體蛋白質(zhì)最佳復性條件；用Ni-NTA親和層析柱純化出高純度的rhIL-21，為大量生主rhIL-21及其生物學研究或臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上以NK92細胞為效應(yīng)細胞，通過對NK92細胞的增殖和殺傷功能的影響以及對表面活化性受體NKG2D的表達的分析，來初步探討IL-21對NK細胞的生物學作用。 方法和結(jié)果： 1.人IL-21基因的克隆和分析 根據(jù)Geneba

8、nk報告的人類IL-21基因序列，我們設(shè)計一對編碼人IL-21成熟肽的引物。上游包含NdeI酶切位點，下游含XhoI酶切位點。 以本實驗室保存的重組質(zhì)粒pcDNA3-IL-21為模板，用所設(shè)計的引物擴增出IL-21目的基因。PCR片段用低熔點瓊脂糖凝膠分離純化并與TA載體pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞，平鋪于含100μg/ml氨芐西林的LB培養(yǎng)板上篩選陽性克隆。再通過PCR、雙酶切及測序方法對陽性克隆進行鑒定，結(jié)果

9、表明成功構(gòu)建了pMD18-T-IL-21重組克隆載體，且無基因突變。 2.重組表達載體pET-30a(+)-IL-21的構(gòu)建及對rhIL-21表達條件的優(yōu)化 用NdeI和XhoI對pMD18-T-IL-21和載體pET-30a(+)進行雙酶切反應(yīng)，低熔點瓊脂糖回收目的片段和經(jīng)雙酶切后的pET-30a(+)，用T4連接酶進行連接反應(yīng)，連接復合物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，平鋪于含50μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)板上篩選

10、陽性克隆。先通過對陽性克隆菌落進行PCR分析，對PCR結(jié)果陽性的克隆提取質(zhì)粒進行雙酶切和基因測序鑒定。提取重組表達質(zhì)粒pET-30a(+)-IL-21，并轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌BL21中，在含50μg/ml卡那霉素的LB板上得到單克隆工程菌BL21/pET-30a(+)-IL-21。 挑取單克隆接種于10ml含卡那霉素(50μg/ml)的LB培養(yǎng)液，37℃活化培養(yǎng)。取活化后菌液接種到新的含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)至A60

11、0nm=1.0～1.2時，以不同的接種比例接種于LB培養(yǎng)液形成不同起始誘導濃度梯度，然后觀察溫度、誘導時間和IPTG濃度對目的蛋白質(zhì)表達量的影響。收集工程菌用SDS-PAGE和WesternBlot分析目的蛋白質(zhì)表達情況。結(jié)果表明42℃是本工程菌發(fā)酵的最佳溫度，初始密度A600nm為0.2和0.4時蛋白質(zhì)表達量較高(分別為34％和32％)。 按上述發(fā)酵方法對表達菌株發(fā)酵培養(yǎng)，收集工程菌離心，超聲波破菌，再低溫高速離心，收取上清和

12、沉淀，用14％聚丙烯酰胺凝膠進行SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果表明本工程菌表達的目的蛋白是以包涵體形式存在的。 3.包涵體的復性和目的蛋白質(zhì)的純化 收集誘導4h的工程菌菌液500ml，3000rpm×10min離心后用50mlBufferA重懸，用超聲波破菌儀破菌，200～300W，10min工作，10min間歇，全程20min。12,000g×30min離心，收集包涵體。用40mlBufferB洗滌包涵體沉淀，12，0

13、00g×30min離心獲得包涵體。包涵體用含8M尿素的20mlBufferC懸起置4℃冰箱8h以上，12,000g×30min離心，棄沉淀。溶解上清中加180mlbufferC稀釋包涵體濃度至0.2～0.3mg/ml。移至透析袋內(nèi)，依次于含0.01％SDS的500mlBufferD、500mlBufferE透析8小時以上，最后在不含有SDS的500mlBufferF中4℃透析8h以上，12,000g×30min離心，棄沉淀，得到復性后蛋

14、白質(zhì)。得到的上清液進行SDS-PAGE電泳分析，并用考馬斯亮藍G-250染色法測蛋白質(zhì)濃度。結(jié)果表明本方法蛋白質(zhì)復性得率達到30％～35％。 根據(jù)Ni-NTASepharose操作說明純化6×Histag目的蛋白質(zhì)：吸取2ml50％的Ni-NTASepharose裝柱；把復性后上清液緩慢加入到Ni-NTA柱上；用1ml的washingbuffer洗柱4次；1mlelutionbuffer洗脫4次，分管收集，用SDS-PAGE分析

15、蛋白質(zhì)分布。結(jié)果表明在洗脫的第二管可以得到大部分目的蛋白質(zhì)，純度大于90％。純化的rhIL-21用0.22μm的微孔濾膜過濾，4℃保存。 4.rhIL-21的生物學活性檢測 取對數(shù)生長期的NK92細胞，于96孔板中接種培養(yǎng)48h后，細胞計數(shù)板計數(shù)觀察不同濃度的rhIL-21對NK92細胞增殖的影響；同時用MTT法檢測rhIL-21刺激的NK92細胞對幾種腫瘤細胞的殺傷效應(yīng)。結(jié)果表明rhIL-21協(xié)同IL-2能夠促進NK9

16、2細胞的增殖，并增強NK92細胞的細胞毒活性。 結(jié)論： 1)成功構(gòu)建了重組表達載體pET-30a(+)-IL-21，建立了rhIL-21在大腸桿菌BL21中的最佳表達條件，rhIL-21表達量占菌體蛋白質(zhì)的32％～34％，目的蛋白質(zhì)主要以包涵體形式存在。 2)初步建立了包涵體復性策略，復性回收率可以達到30％～35％。用Ni-NTA親和層析柱純化可以得到純度＞90％的rhIL-21。 3)初步得到了具有生