重組大鼠白細(xì)胞介素18(rrIL-18)的畢赤酵母表達(dá)及其對大鼠肝細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的作用研究.pdf

1、白細(xì)胞介素18(IL-18)又稱IFN-y誘導(dǎo)因子(IGIF)，是上世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，主要由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。IL-18能夠誘導(dǎo)Thl、NK、T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，具有抗腫瘤、抗病原微生物以及抗超敏反應(yīng)等生物學(xué)功能，另外IL-18還與Ⅰ型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病有關(guān)。由此可見，IL-18具有多種生物學(xué)功能并且有潛在的臨床應(yīng)用價值。本文研究了大鼠白細(xì)胞介素18在畢赤酵母(Pichiapastoris)中的表達(dá)

2、，并摸索了重組大鼠IL-18的純化工藝，以及rrIL-18對大鼠肝細(xì)胞的增殖作用研究。
　　 本文研究不同載體，菌株組合對rrIL-18表達(dá)水平的影響時發(fā)現(xiàn):在表達(dá)rrIL-18時，pPICZa系列載體作為表達(dá)載體要優(yōu)于pPIC9系列表達(dá)載體;而選用X-33菌株的rrIL-18表達(dá)水平要優(yōu)于GS115菌株，說明選用X-33作為宿主菌有利于提高rrIL-18的表達(dá)量。
　　 本文研究3L發(fā)酵罐規(guī)模下不同因素對rrIL-18

3、表達(dá)水平的影響時發(fā)現(xiàn)，不同的起始誘導(dǎo)密度、溶解氧體積分?jǐn)?shù)(DO)、pH、溫度、甲醇濃度以及甘油添加量等培養(yǎng)條件對rrIL-18表達(dá)水平均有影響。最佳表達(dá)條件為一級種子以10％的接種量接入基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，起始誘導(dǎo)密度為750，發(fā)酵過程中保持DO在20％，誘導(dǎo)溫度22℃，pH=5.75，甲醇電極控制甲醇濃度在0.25％，誘導(dǎo)過程中添加甘油2g/(L-h)，發(fā)酵全過程由發(fā)酵罐控制系統(tǒng)進(jìn)行在線控制和數(shù)據(jù)采集。最佳表達(dá)條件下，誘導(dǎo)144h后rrI

4、L-18表達(dá)量接近0.35g/L。
　　 本文摸索了分離純化rrIL-18的條件，結(jié)果表明，運用超濾、等電點沉淀、乙醇沉淀以及疏水層析依次對rrIL-18的3L發(fā)酵液進(jìn)行分離純化，可獲得純度90％左右的目的產(chǎn)物。
　　 本文初步檢測了rrIL-18對大鼠肝細(xì)胞生長增殖作用，BrdU免疫熒光法測得結(jié)果發(fā)現(xiàn)rrIL-18對大鼠肝細(xì)胞有增殖作用，其增殖作用隨濃度的升高而增強(qiáng);但當(dāng)其濃度超過一定值后對肝細(xì)胞的增殖作用不明顯。從而