山羊乳牙牙髓細胞向成骨細胞誘導分化的體內(nèi)外研究.pdf

1、背景：
　　 骨量不足的問題一直是困擾口腔種植外科發(fā)展的一大難題，自體骨，異體骨和組織工程骨是目前骨組織缺損修復的三大來源。其中，自體骨由于來源受限及給患者帶來二次創(chuàng)傷，異體骨由于免疫排斥性等缺陷限制其各自在臨床上的應用，相比較而言，組織工程骨由于具有自生性，無免疫排他性，安全性，已成為目前骨缺損修復的研究熱點。自從Gronthos 等[1]發(fā)現(xiàn)人恒牙牙髓來源的細胞中存在干細胞以來，有關運用牙髓來源干細胞組織工程化成骨的研究不斷

2、深入，Mirus 等[2]證實相比較人恒牙牙髓干細胞（human Dental pulp stem cells , DPSCs）而言，人乳牙牙髓干細胞（Stem cells from human exfoliated deciduous teeth, SHED）具有更佳的成骨分化誘導能力，其更適合作為頜面骨缺損組織工程骨修復的種子細胞。
　　 目的：
　　 （1）分離培養(yǎng)山羊乳牙牙髓細胞和骨髓間充質(zhì)細胞，并對其進行相關干

3、細胞特性鑒定。
　　 （2）礦化誘導山羊乳牙牙髓細胞和骨髓間充質(zhì)細胞，比較兩種細胞體外礦化成骨能力。
　　 （3）比較山羊乳牙牙髓細胞和骨髓間充質(zhì)細胞復合多孔磷酸鈣骨水泥（pCPC）支架材料回植于裸鼠皮下成骨效果。
　　 方法：
　　 （1）全麻下拔除山羊第一、二乳前磨牙，采用改良酶解組織塊法培養(yǎng)山羊乳牙牙髓細胞；抽取山羊髂前上嵴區(qū)骨髓，采用全骨髓法培養(yǎng)山羊骨髓間充質(zhì)細胞。
　　 （2）體外培養(yǎng)擴

4、增山羊乳牙牙髓細胞、骨髓間充質(zhì)細胞，觀察細胞生長情況，采用免疫組織化學法檢測細胞來源，流式細胞儀檢測干細胞表面標記物（STRO-1），MTT法檢測細胞增殖情況。
　　 （3）體外培養(yǎng)擴增山羊乳牙牙髓細胞、骨髓間充質(zhì)細胞，經(jīng)成骨誘導條件培養(yǎng)基（含地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C）培養(yǎng)后觀察細胞生長情況，采用堿性磷酸酶（ALP）染色法、茜素紅鈣結節(jié)染色法檢測細胞體外礦化能力；采用RT-PCR 和Real-time PCR 技術檢測

5、成骨基因ALP、COL-I、OPN、OCN 表達情況；采用免疫組織化學染色方法檢測成骨標記物OCN 在細胞內(nèi)的表達情況；通過掃描電鏡觀察誘導后細胞在pCPC 支架材料上黏附、增殖情況。
　　 （ 4）將體外培養(yǎng)擴增誘導7d 后的山羊乳牙牙髓細胞、骨髓間充質(zhì)細胞按2×107cell/ml 密度接種于支架材料pCPC 支架材料上，異位回植于裸鼠皮下；8w 后，取出移植物，石蠟包埋切片后分別HE 染色、免疫組織化學染色觀察骨組織形成及

6、成骨蛋白（OCN）表達情況。
　　 結果：
　　 （1）采用改良酶解組織塊法培養(yǎng)山羊乳牙牙髓細胞，一般3-4d 組織塊周圍有細胞“游離”，6-7d 游離出細胞的組織塊周圍可見細胞“生長暈”形成，14-18d 組織塊間細胞增殖相接，細胞間相互擠壓，可以進行首次傳代；傳代后， 5d 細胞鋪滿皿底90％以上；采用全骨髓法培養(yǎng)山羊骨髓間充質(zhì)細胞， 5-7d 首次換液后，就可以看到細胞克隆形成，15-20d 后可以首次傳代；傳代后

7、， 7d 細胞鋪滿皿底90％以上。
　　 （2）倒置相差顯微鏡下觀察，山羊乳牙牙髓細胞、骨髓間充質(zhì)細胞形態(tài)均呈“成纖維細胞”樣，免疫組化來源檢測胞漿抗角蛋白陰性、抗波絲蛋白陽性，說明均來源于間充質(zhì)；流式細胞儀檢測：第一代乳牙牙髓細胞表面表達STRO-1 陽性率為11.6％，第一代骨髓間充質(zhì)細胞表面表達STRO-1 陽性率為15.33％。MTT 法檢測顯示山羊乳牙牙髓細胞倍增時間為4.38d，骨髓間充質(zhì)細胞倍增時間為5.69d，說

8、明山羊乳牙牙髓細胞增殖能力較骨髓間充質(zhì)細胞強。
　　 （3）礦化誘導培養(yǎng)后，堿性磷酸酶（ALP）活性試驗顯示山羊乳牙牙髓細胞誘導7d 后OD 值為1.33±0.009，ALP 活性顯著增加，14d 后OD 值為3.59±0.107,ALP 活性達最高；山羊骨髓間充質(zhì)細胞誘導10d 后OD 值為2.03±0.027，ALP 活性顯著增加，14d 后OD 值為3.49±0.647，ALP 活性達最高；茜素紅鈣結節(jié)染色法顯示誘導21d

9、 后山羊乳牙牙髓細胞、骨髓間充質(zhì)細胞均能分泌胞外基質(zhì)，形成礦化結節(jié)；
　　 RT-PCR 及Real-time PCR 顯示山羊乳牙牙髓細胞、骨髓間充質(zhì)細胞成骨誘導前后均表達成骨基因ALP、COL-I、OPN、OCN，但誘導后表達量增加，其中ALP、OCN相對表達量增加顯著；掃描電鏡試驗顯示誘導7d 后山羊乳牙牙髓細胞、骨髓間充質(zhì)細胞能夠很好的黏附于pCPC 支架材料上，并能夠在其上增殖、分泌胞外基質(zhì)。
　　 （4）裸鼠

10、皮下異位移植8w 后，標本切片HE 染色顯示山羊乳牙牙髓細胞新生骨樣組織量顯著多于骨髓間充質(zhì)細胞，新生骨樣組織百分比分別為20.81±4.50％、13.18±1.05％（P<0.05）；單純材料組切片HE 染色顯示無骨樣組織形成，可見部分未被吸收的材料顆粒及形成的血管組織；免疫組織化學染色顯示圍繞骨樣組織周圍的成骨樣細胞胞漿抗OCN 染色陽性。
　　 結論：
　　 （1）改良酶解組織塊法可以較快地培養(yǎng)出山羊乳牙牙髓細胞；

11、干細胞表面標記抗原（STRO-1）流式細胞儀檢測顯示培養(yǎng)的山羊乳牙牙髓細胞和骨髓間充質(zhì)細胞中均存在干細胞；相比較山羊骨髓間充質(zhì)細胞，山羊乳牙牙髓細胞具有更強的增殖能力。
　　 （2）成骨誘導培養(yǎng)后山羊乳牙牙髓細胞、骨髓間充質(zhì)細胞具有相似的體外成骨能力和成骨基因表達模式。
　　 （3）裸鼠皮下異位移植8w 后，山羊乳牙牙髓細胞或骨髓間充質(zhì)細胞復合pCPC 支架材料形成骨樣組織，且乳牙牙髓細胞異位成骨能力明顯強于骨髓間充質(zhì)細