低氧條件下BNIP3對表皮細胞遷移的影響及其機制研究.pdf

1、創(chuàng)面愈合是在多種組織和細胞協(xié)同作用下共同完成的精密調(diào)控的過程。再上皮化是創(chuàng)面愈合進程中早期啟動的生物學(xué)事件，在重建皮膚機械屏障的完整性中發(fā)揮重要作用，而表皮細胞遷移是貫穿于這一過程的關(guān)鍵步驟，已成為創(chuàng)面愈合研究的焦點。但低氧微環(huán)境對創(chuàng)面愈合過程中皮膚表皮細胞遷移是否具有調(diào)控作用及其分子調(diào)控機制，迄今均未完全闡明。
　　BNIP3（Bcl-2 nineteen-kilodalton interacting protein3）是僅含有

2、非典型BH3結(jié)構(gòu)域的Bcl-2蛋白質(zhì)家族的成員之一，是一種低氧反應(yīng)蛋白。大量文獻證實BNIP3參與細胞增殖、凋亡、自噬、分化等生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)，并且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展，心肌肥大與萎縮，腦缺血缺氧損害等多種疾病過程中發(fā)揮重要作用。BNIP3分布在人表皮細胞中，并參與調(diào)控其分化并維持其自穩(wěn)態(tài)。但BNIP3對表皮細胞遷移是否具有調(diào)控作用，目前尚無相關(guān)文獻報道。
　　創(chuàng)面形成后，多種信號通路激活并動員創(chuàng)面修復(fù)細胞，加速創(chuàng)面再上皮化進程。黏著

3、斑激酶(FAK)是分布于細胞質(zhì)中的一種酪氨酸蛋白激酶，在整合素家族調(diào)控細胞運動中發(fā)揮核心作用，主要通過397號位點的酪氨酸自磷酸化而激活。大量文獻資料表明FAK參與創(chuàng)面愈合過程中表皮細胞遷移的調(diào)控。特異性的整合素單克隆抗體的應(yīng)用可下調(diào)FAK的活化水平并抑制表皮細胞遷移;FAK缺失的小鼠創(chuàng)面愈合明顯延遲，這與FAK的活化受阻密切相關(guān)。在多種腫瘤中，F(xiàn)AK信號轉(zhuǎn)到途徑及其下游信號參與調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架的聚合、解聚及重排等細胞遷移相關(guān)的關(guān)鍵

4、環(huán)節(jié)，而BNIP3可以調(diào)節(jié)細胞肌動蛋白骨架的重構(gòu)。因此我們推測，F(xiàn)AK可能參與了BNIP3對表皮細胞遷移的調(diào)控。
　　在多種哺乳動物細胞的研究中發(fā)現(xiàn)BNIP3可通過其BH3結(jié)構(gòu)域競爭Bcl-2與Beclin-1的結(jié)合位點破壞Bcl-2/Beclin-1的穩(wěn)定結(jié)合，從而啟動自噬(Autophagy)。自噬是真核細胞中高度保守的一種溶酶體降解途徑，在維持機體的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。功能學(xué)上，自噬參與調(diào)控多種生理及病理過程，如生長發(fā)育、炎

5、癥反應(yīng)、腫瘤的發(fā)生與侵襲轉(zhuǎn)移等。近年來，表皮細胞自噬的生物學(xué)意義也受到了廣泛關(guān)注。某些具有生物活性的物質(zhì)或理化因素可誘導(dǎo)表皮細胞自噬;自噬參與調(diào)控表皮細胞分化;自噬可減少紫外線照射引起的表皮細胞損傷，促進其存活。然而，自噬對表皮細胞遷移的影響尚缺乏研究證據(jù)。
　　目的：
　　本研究提出低氧條件下BNIP3通過調(diào)節(jié)FAK或自噬進而調(diào)控創(chuàng)面愈合過程中表皮細胞遷移的假設(shè)，通過檢測低氧條件下BNIP3對表皮細胞遷移的影響，并探討其對

6、表皮細胞FAK及自噬的調(diào)節(jié)，從而明確BNIP3調(diào)節(jié)表皮細胞遷移的作用機制。
　　方法：
　　1.建立體外低氧培養(yǎng)的小鼠原代表皮細胞模型，模擬創(chuàng)面低氧微環(huán)境，觀察低氧(2％O2:3h、6h、9h)處理前后表皮細胞運動性和遷移及BNIP3蛋白表達的變化規(guī)律;
　　2.通過siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建BNIP3下調(diào)的小鼠原代表皮細胞模型并進行低氧處理(2％O2:6h)，WB檢測siRNA轉(zhuǎn)染的有效性;在活細胞工作站下觀察BNIP3

7、下調(diào)對表皮細胞運動性的影響;體外片層細胞劃痕實驗?zāi)M創(chuàng)面愈合過程，觀察BNIP3下調(diào)對表皮細胞遷移的影響，從而明確低氧條件下BNIP3對表皮細胞遷移的調(diào)控作用;
　　3.通過WB檢測低氧(2％O2:3h、6h、9h)處理前后表皮細胞中p-FAK表達及自噬的變化;并檢測低氧條件下BNIP3下調(diào)對表皮細胞FAK及自噬的影響;通過TAE226選擇性抑制FAK的活化檢測低氧條件下FAK對表皮細胞運動性及遷移的調(diào)控;最后，在常氧條件下用雷帕

8、霉素激活自噬，檢測自噬對表皮細胞運動性及遷移的影響，從而初步明確低氧條件下BNIP3調(diào)控表皮細胞遷移的可能作用機理。
　　結(jié)果：
　　1.低氧促進小鼠原代表皮細胞的運動性及遷移，并顯著上調(diào)BNIP3的表達，且隨低氧處理時間延長呈上升趨勢，這與表皮細胞運動性隨低氧處理時間變化的規(guī)律基本契合;
　　2.應(yīng)用靶向BNIP3的siRNA序列下調(diào)BNIP3，通過單個細胞運動性檢測（活細胞工作站觀察）及體外細胞劃痕實驗，我們發(fā)現(xiàn)B

9、NIP3的下調(diào)可有效地逆轉(zhuǎn)低氧對表皮細胞運動性及遷移的促進作用，說明BNIP3參與調(diào)控低氧促進的表皮細胞遷移;
　　3.低氧處理促進FAK的活化，并使自噬標志物L(fēng)C3-Ⅱ、p62顯著上調(diào);低氧條件下用siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)BNIP3可顯著抑制FAK信號通路的激活，并且抑制FAK的活性可逆轉(zhuǎn)低氧表皮細胞遷移的促進作用，說明FAK信號通路參與了低氧條件下BNIP3介導(dǎo)的表皮細胞遷移;低氧條件下下調(diào)BNIP3可顯著抑制LC3-Ⅱ的上調(diào)，說明

10、低氧條件下BNIP3對表皮細胞自噬具有調(diào)控作用;但盡管常氧條件下雷帕霉素可顯著抑制表皮細胞遷移，雷帕霉素模擬的自噬與低氧處理誘導(dǎo)的自噬不盡相同，要明確BNIP3是否通過自噬調(diào)節(jié)表皮細胞遷移尚需要進一步研究。
　　結(jié)論：
　　低氧上調(diào)表皮細胞中BNIP3的表達，并促進FAK信號通路的的活化，從而促進表皮細胞遷移;同時低氧可激活自噬，但自噬是否參與低氧條件下BNIP3對表皮細胞遷移的調(diào)控尚需進一步研究。
　　本研究首次明確