低氧條件下Notch1信號下調(diào)對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移影響研究.pdf

1、目的:低氧是一種常見的病理生理狀態(tài)，腦動(dòng)靜脈畸形由于其低灌注狀態(tài)及內(nèi)皮損傷因素導(dǎo)致畸形血管團(tuán)內(nèi)皮細(xì)胞處于低氧狀態(tài)。腦動(dòng)靜脈畸形的不斷長大、反復(fù)出血、治療后復(fù)發(fā)等問題嚴(yán)重危害病人健康，其機(jī)制尚不明確，但有研究證實(shí)BAVM的內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力明顯提高。內(nèi)皮細(xì)胞作為BAVM組成和血管新生的主要參與細(xì)胞，在決定病變生物學(xué)行為及相關(guān)因子介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)中起到至關(guān)重要的作用。內(nèi)皮細(xì)胞中的Notch通道是高度保守的細(xì)胞信號通道，參與調(diào)控細(xì)胞的發(fā)育、增殖、

2、遷移、凋亡等過程，已有研究證實(shí)腦動(dòng)靜脈畸形的血管內(nèi)皮細(xì)胞中Notch1及其靶基因Hes1處于上調(diào)狀態(tài)，說明Notch信號通道被激活。臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞由于具有人體內(nèi)絕大多數(shù)血管內(nèi)皮細(xì)胞代謝和對外界生理、毒理反應(yīng)特征，常被作為內(nèi)皮模型。本研究以臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為模型，試圖通過觀察常氧和低氧條件下內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移情況，運(yùn)用蛋白質(zhì)印跡法分析Notch1蛋白的表達(dá)情況及real-time PCR法檢測內(nèi)皮細(xì)胞中Notch1 mRNA及其靶基基因H

3、es1 mRNA的表達(dá)來研究Notch信號通道激活情況;然后利用γ分泌酶抑制劑(DAPT)阻斷臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Notch通道，觀察低氧狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移行為的改變與該通道的關(guān)系，探討B(tài)AVM的發(fā)生及出血機(jī)制并提供相關(guān)線索，對BAVM疾病更有效的治療提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　方法:分別在常氧和5％O2濃度條件下培養(yǎng)人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。低氧培養(yǎng)的HUVEC分為溶劑對照組和不同濃度(10、20、30、40uM/L)藥物DAPT組。分組

4、情況具體為:1常氧組，2低氧組，3溶劑對照的低氧組，410uM/L藥物組，520uM/L藥物組，630uM/L藥物組，740uM/L藥物組。
　　1、CCK8試劑盒檢測細(xì)胞增殖:將對數(shù)生長期的細(xì)胞按上述分組情況分為7組，予以加藥及溶劑對照處理，分別在常氧或低氧(5％O2)條件下培養(yǎng)。24小時(shí)后測量OD值大小。用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，分析常和低氧情況下細(xì)胞增殖情況是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異，并分析不同濃度藥物DAPT處理后

5、低氧條件下得臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖情況是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2、內(nèi)皮細(xì)胞遷移檢測:將對數(shù)生長期的細(xì)胞按上述分組情況分為7組，把細(xì)胞種植到懸掛式培養(yǎng)皿上室，予以加藥及溶劑對照處理，常氧或5％O2氧濃度作為不同培養(yǎng)條件。24小時(shí)后在顯微鏡放大400倍下觀察細(xì)胞穿過小室濾膜數(shù)目，以穿過膜多少評估細(xì)胞遷移能力。SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析常氧低氧組之間，及低氧組不同濃度藥物處理后細(xì)胞的遷移能力是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3、蛋白質(zhì)印跡法(

6、western blot)分析:將對數(shù)生長期的細(xì)胞按上述分組情況分為7組，予以加藥及溶劑對照處理，常氧或低氧(5％O2)條件下培養(yǎng)24小室后。提取總蛋白，蛋白質(zhì)印跡法測量不同組臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的Notch1因子的蛋白表達(dá)水平。SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析常氧低氧組之間，及低氧組不同濃度藥物處理后細(xì)胞后內(nèi)皮細(xì)胞的Notch1蛋白表達(dá)是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4、Real-time PCR分析:將對數(shù)生長期的細(xì)胞按上述分組情

7、況分為7組，予以加藥及溶劑對照處理，常氧或低氧(5％O2)條件下培養(yǎng)24小室后。Real-timePCR測量轉(zhuǎn)錄水平mRNA的表達(dá)，常氧組、低氧組間Notch1 mRNA、Hes1 mRNA的表達(dá)水平用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，并用同樣方法檢測不同藥物濃度處理后各組之間Notch1、Hes1基因表達(dá)是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、CCK8試劑盒檢測細(xì)胞增殖，與常氧條件下培養(yǎng)24小時(shí)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞相比，在5％低氧組

8、24小時(shí)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞的增殖明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。加入不同濃度(10、20、30、40uM/L)藥物DAPT阻斷NOTCH信號通路以后在低氧條件下培養(yǎng)24小時(shí)，當(dāng)藥物濃度為30uM/L時(shí)，增殖情況開始遭到顯著抑制，并且藥物濃度越高組，細(xì)胞增殖越能力弱，差異明顯(P＜0.01)。
　　2、內(nèi)皮細(xì)胞遷移檢測結(jié)果提示，比較低氧組2與常氧組1，低氧組細(xì)胞在5％低氧24小時(shí)條件下培養(yǎng)后，細(xì)胞穿過濾膜數(shù)目增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。加入不同

9、濃度藥物后，隨著藥物濃度增加，5（20uM/L藥物組）、6（30uM/L藥物組）、7（40uM/L藥物組）的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞穿過濾膜數(shù)量逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3、western blot結(jié)果提示，比較1與2組，2組細(xì)胞蛋白表達(dá)增加，兩組對比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。加入γ分泌酶抑制劑(DAPT)后，Nocth1的蛋白表達(dá)受到抑制，這種抑制隨著藥物濃度增大而增加，5（20uM/L DAPT組）、6(30uM/LDAPT組)、7（

10、40uM/L DAPT組）組的Nocth1的蛋白表達(dá)顯著減低，呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4、Real-time PCR結(jié)果，1組提示常氧條件下Notch1 mRNA、Hes1 mRNA均有表達(dá)，5％氧濃度24 h條件下培養(yǎng)下的2組細(xì)胞，Notch1 mRNA、Hes1轉(zhuǎn)錄水平mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，加入DAPT后的4、5、6、5組兩個(gè)目標(biāo)基因mRNA的均表明顯降低，藥物濃度越大，基因表達(dá)水平越低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。<