大鼠肝臟缺血-再灌注中線粒體DNA損傷與修復(fù)機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的：本課題針對(duì)臨床上肝臟缺血-再灌注損傷(hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI)中線粒體DNA損傷與修復(fù)的機(jī)制進(jìn)行初步研究，主要有如下幾點(diǎn)：1、肝細(xì)胞線粒體DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）損傷引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制；2、mtDNA損傷的常見位點(diǎn)；3、線粒體聚合酶γ修復(fù)受損mtDNA的途徑及靶點(diǎn)；4、雷帕霉素對(duì)線粒體的保護(hù)作用及機(jī)制。對(duì)上述問題從基因水平探討 mtDNA損傷

2、在肝臟缺血-再灌注損傷中的作用，為肝臟缺血-再灌注損傷的治療提供理論依據(jù)。
　　方法:第一部分：肝臟缺血-再灌注中線粒體DNA損傷及修復(fù)的機(jī)制，建立大鼠全肝缺血-再灌注損傷模型，測定血清 AST、ALT；取出肝臟作病理學(xué)檢測；mtDNA D-loop區(qū)擴(kuò)增測序，查找變異位點(diǎn)；RT-PCR檢測肝組織內(nèi)線粒體DNA聚合酶γmRNA的表達(dá)情況。第二部分：雷帕霉素在肝臟缺血-再灌注中對(duì)肝細(xì)胞線粒體的保護(hù)機(jī)制，建立大鼠全肝缺血-再灌注損傷模

3、型，用雷帕霉素進(jìn)行干預(yù)。提取肝組織蛋白，western blot檢測細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)水平；取肝臟組織行原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測肝細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果：第一部分：肝臟缺血-再灌注后早期（24h），大鼠血清AST、ALT均升高，肝組織病理學(xué)變化較重，線粒體DNA聚合酶γmRNA表達(dá)量均升高，其中雷帕霉素干預(yù)組AST、ALT及肝組織病理學(xué)改變和線粒體DNA聚合酶γmRNA表達(dá)量明顯低于未給藥組（p<0.01）；24h后

4、血清AST、ALT均降低，為給藥組線粒體DNA聚合酶γmRNA表達(dá)量逐漸降低，雷帕霉素干預(yù)組則較未給藥組為低（p<0.01）且術(shù)后一直維持在同一水平；雷帕霉素干預(yù)組mtDNA D-loop區(qū)DNA突變率明顯低于未給藥組（p<0.01）。第二部分：肝臟缺血-再灌注后各時(shí)間點(diǎn),大鼠肝臟細(xì)胞色素C表達(dá)水平均升高，其中雷帕霉素干預(yù)組細(xì)胞色素C的表達(dá)水平較未給藥組為低（p<0.01），24h后各組細(xì)胞色素 C的表達(dá)水平逐漸降低，但各時(shí)間點(diǎn)雷帕霉素

5、干預(yù)組細(xì)胞色素C的表達(dá)水平均較未給藥組為低（p<0.01）。各組各時(shí)間點(diǎn)檢測肝細(xì)胞凋亡與細(xì)胞色素 C表達(dá)水平的變化相同，即各時(shí)間點(diǎn)雷帕霉素干預(yù)組肝細(xì)胞凋亡水平均較未給藥組為低（p<0.01）。
　　結(jié)論：（1）肝臟缺血-再灌注損傷中存在線粒體DNA突變，且突變率與缺血時(shí)間呈正相關(guān)，而雷帕霉素降低線粒體DNA突變率。（2）細(xì)胞在肝臟缺血-再灌注損傷的修復(fù)中線粒體DNA聚合酶γmRNA表達(dá)量升高，其表達(dá)水平與線粒體DNA損傷程度相一致

6、，而雷帕霉素可以抑制HIRI中線粒體DNA聚合酶γ mRNA的過度表達(dá)，更利于修復(fù)受損的線粒體DNA。（3）肝臟缺血-再灌注損傷使組織中細(xì)胞色素C表達(dá)水平升高、肝組織細(xì)胞凋亡，且隨缺血時(shí)間的延長表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡程度亦升高，表明肝臟缺血時(shí)間越長，肝細(xì)胞凋亡程度越重，（4）雷帕霉素對(duì)肝細(xì)胞有保護(hù)作用，能降低線粒體DNA突變率；抑制肝臟缺血-再灌注損傷中線粒體DNA聚合酶γmRNA的過度表達(dá)，更利于修復(fù)受損的線粒體DNA及減輕肝細(xì)胞凋亡，從