大鼠全肝缺血再灌注后肝腎及線粒體損傷的機制和防護.pdf

1、背景和目的：
　　 肝臟缺血再灌注損傷為肝臟外科常見的病理生理過程。特別是90年代后，隨著肝移植例數(shù)的逐年增加，供肝短缺的矛盾日益嚴重，移植界開始關注從無心跳供者(NHBD)獲取供肝，對肝移植過程中的缺血再灌注損傷的研究日趨重視，從而廣泛開展了對全肝缺血再灌注損傷的研究。肝臟的缺血及再灌注過程，勢必給其它臟器帶來損傷，肝缺血及門靜脈瘀血可產生大量有害炎癥介質，包括酸性代謝產物、內毒素、氧自由基、腫瘤壞死因子和其它炎癥介質。這些有

2、害炎癥介質在肝血流恢復后立即傾注入肺，造成急性肺損傷和呼吸衰竭，流經腎臟組織，造成腎功能不全。門脈血流阻斷后可使門脈壓力增加，引起胃腸道毛細血管高壓性受損，微循環(huán)障礙，消化道粘膜水腫、出血、壞死，形成內毒素血癥及腸道細菌移位，給全身臟器帶來威脅。腎臟是人體一個重要的代謝器官，其功能下降嚴重影響病人手術后的生存率，給移植成功帶來了巨大的困難。本實驗通過手術方法建立大鼠全肝缺血再灌注的創(chuàng)傷模型，觀察再灌注損傷中炎性反應、脂質過氧化反應，H2

3、S/CSE體系、CaN信號轉導通路的變化，以尋找有效的干預措施。
　　 方法：本實驗通過手術方法建立大鼠全肝缺血再灌注的創(chuàng)傷模型。第一部分缺血再灌注實驗分組：雄性Wistar大鼠88只，隨機分為11組，每組8只：
　　 1.正常對照組；
　　 2.全肝缺血20min組，再灌注2h、6h、12h、24h、48h、72h組；
　　 即20min、20min+2h、20min+6h、20min+12h、20mi

4、n+24h、20min+48h、20min+72h。
　　 3.全肝缺血40min組，再灌注6h、72h組；
　　 即40min、40min+6h、40min+72h。
　　 第一部分藥物干預實驗分組：雄性Wistar大鼠96只，隨機分為12組，每組8只；
　　 1.FK506空白對照組：假手術后給予腹腔注射FK506(0.1mg/kg)。
　　 螺內酯空白對照組：螺內酯每天灌胃(20mg/kg)

5、持續(xù)6天后假手術。
　　 甲潑尼龍(MP)空白對照組：假手術后立即給予腹腔注射MP(30mg/kg)。
　　 NaHS空白對照組：假手術后立即給予腹腔注射NaHS(28ymol/kg)。
　　 2.缺血20min再灌6h藥物干預組：
　　 20min+6h+FK506組：再通后腹腔注射FK506，再灌注后6h處死。
　　 20min+6h+螺內酯組：螺內酯每天灌胃，6天后手術。
　　 20

6、min+6h+MP組：再通后給予腹腔注射MP，再灌注后6h處死。
　　 20min+6h+NaHS組：再通后給予腹腔注射NaHS，再灌注后6h處死。
　　 3.缺血40min再灌6h藥物干預組：
　　 40min+6h+螺內酯組：螺內酯術前6天每天灌胃，再灌注后6h處死。
　　 40min+6h+MP組：再通后立即給予腹腔注射MP，再灌后6h處死。
　　 4.缺血40min再灌72h藥物干預組：<

7、br>　　 40min+72h+螺內酯組：螺內酯術前6天每天灌胃，再灌后72h處死。
　　 40min+72h+MP組：再通后立即給予腹腔注射MP，再灌后72h處死。
　　 第二部分線粒體損傷及干預實驗分組：雄性Wistar大鼠80只，隨機分為10組，每組8只：
　　 正常對照組、20min+6h、藥物干預及藥物空白組。
　　 本實驗通過手術方法建立大鼠全肝缺血再灌注的創(chuàng)傷模型，動態(tài)檢測血漿H2S、丙二

8、醛(MDA)、血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)、醛固酮(aldosterone，ALD)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、丁酰膽堿酯酶(BuChE)、谷丙轉氨酶(ALT)、胱抑素C(CysC)的變化，檢測肝臟及腎臟CSE活性，細胞間粘附分子(ICAM—1)、核因子NF-κB含量，腎損傷分子-1(KIM-1)含量，鈣調神經磷酸酶(calcineurin，CaN)含量，同時光鏡HE染色下觀察其二者的病理變化及線粒

9、體呼吸功能、膜電位及線粒體ATP酶的變化。應用H2S供體NaHS、CaN抑制劑FK506及醛固酮拮抗劑螺內酯和甲潑尼龍進行干預，觀察上述指標變化，進一步研究H2S、CaN及醛固酮在全肝缺血再灌注損傷中的信號傳導機制及各信號通路之間的相互作用，同時研究NaHS、CaN抑制劑FK506及醛固酮受體拮抗劑螺內酯和甲潑尼龍對肝腎的干預作用。
　　 結果：
　　 第一部分結果：與正常對照組比較，血清ALT、血清CysC、血清TNF

10、-α、血清MDA、血漿Ang II水平、腎臟KIM-1水平、肝臟ICAM-1、NF-κB水平在缺血及再灌注后開始升高，再灌注6h達到峰值。血漿BuChE缺血及再灌注后逐漸降低，于再灌注24h時降到最低值，于再灌注72h恢復到正常水平。血漿ALD、腎臟ICAM-1、NF-κB在全肝缺血20min增高并達到高峰，再灌注后開始降低。肝臟ALD同樣在缺血20min后開始升高，但不同于血漿ALD，于再灌注2h達到峰值。血清H2S在缺血20min時

11、降低，于再灌注2h恢復正常水平，然后隨再灌注時間逐漸升高，6h達到峰值，隨后逐漸降低，于再灌注12h再次恢復到基線水平。肝腎CSE酶活性在缺血20min顯著降低，再灌注后各組CSE酶活性均較缺血20min組升高。肝腎CaN在缺血20min時開始降低降低，且隨再灌注時間逐漸降低，分別于12h和6h達到最低值。FK506、螺內酯、MP、NaHS干預均使血清TNF-α、MDA、腎臟KIM-1、肝腎ICAM-1、NF-κB水平降低；螺內酯干預使

12、血漿Ang II降低，血漿ALD升高；FK506、螺內酯、NaHS和MP使CaN含量降低；NaHS干預提高血清H2S和組織CSE酶活性；MP干預降低血清ALT水平，提高血漿BuChE含量。
　　 第二部分結果：于正常對照組比較，缺血再灌注后，肝腎線粒體ATP酶活性改變，RCR、P/O、膜電位均降低，藥物干預后，各項指標均有不同程度的改善。
　　 結論：
　　 全肝缺血再灌注后可造成肝臟本身和腎臟的損傷，于再灌注6