大鼠肝缺血再灌注損傷的線粒體機(jī)制研究及積雪草酸靶向線粒體解偶聯(lián)的肝保護(hù)作用.pdf

1、目的：
　　本課題通過(guò)建立大鼠肝缺血/再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）模型和大鼠肝線粒體缺氧復(fù)氧（Anoxia/reoxygenation,A/R）損傷模型，研究肝I/R損傷的相關(guān)線粒體機(jī)制，提出線粒體保護(hù)的重要性。同時(shí)，首次研究積雪草酸（Asiatic acid, AA）對(duì)大鼠肝I/R損傷的保護(hù)作用及相關(guān)線粒體機(jī)制。在離體線粒體水平和細(xì)胞水平探討AA對(duì)線粒體功能的直接影響，從線粒體水平深入闡明其肝保護(hù)作

2、用機(jī)制。利用藥物親和反應(yīng)性的靶點(diǎn)穩(wěn)定性（drug affinity responsive target stability,DARTS）技術(shù)確定AA在小鼠肝臟線粒體上的直接作用靶點(diǎn)，進(jìn)一步闡明其活性的機(jī)制。
　　方法：
　　健康雄性SD大鼠30只，質(zhì)量230-250g，隨機(jī)分為5組(n=6)，包括假手術(shù)組(SHAM組)、肝I/R組和不同劑量AA組。SHAM組僅暴露肝門(mén)，不夾閉血管。IR組采用夾閉左、中葉肝蒂、門(mén)靜脈和肝動(dòng)脈支

3、1 h，然后松開(kāi)血管夾恢復(fù)血流6 h的方法制備大鼠肝I/R模型。AA組于肝缺血前12 h和1 h分別灌胃給藥兩次。各實(shí)驗(yàn)組于再灌注6 h抽取下腔靜脈血樣并取肝組織。采用試劑盒測(cè)定血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性和TNF-α含量；通過(guò)HE染色，光鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化；采用試劑盒檢測(cè)肝組織中ATP和MDA水平以及SOD、過(guò)氧化氫酶活性。再灌注6 h后，采用差速離心法分離各組肝線粒體，Clark氧電極法檢測(cè)線粒體呼吸功能；采用試劑盒檢測(cè)線粒

4、體中ATP和MDA水平；利用羅丹明123（Rhodamine123,Rh123）熒光探針檢測(cè)線粒體膜電位（Mitochondrial membrane potential,MMP）。差速離心法分離健康大鼠肝線粒體，采用Amplex red/辣根過(guò)氧化物酶法檢測(cè)AA對(duì)不同底物條件下線粒體ROS生成的影響。利用Clark氧電極建立線粒體A/R損傷模型，通過(guò)線粒體在密閉體系中的呼吸耗氧誘導(dǎo)缺氧，缺氧5 min后，加入新鮮呼吸介質(zhì)實(shí)現(xiàn)復(fù)氧，然后

5、加入ADP后測(cè)定線粒體呼吸參數(shù)。通過(guò)Amplex red/辣根過(guò)氧化物酶法檢測(cè)線粒體A/R生成的ROS。
　　分別采用密度梯度離心和差速離心法分離小鼠腦和肝線粒體。利用Clark氧電極研究線粒體呼吸和細(xì)胞呼吸耗氧速率。分別采用DCFH-DA熒光探針和Amplex red/辣根過(guò)氧化物酶法檢測(cè)小鼠腦和肝線粒體呼吸過(guò)程中ROS的產(chǎn)生。利用Rh123和JC-1熒光探針?lè)謩e檢測(cè)離體線粒體和HepG2細(xì)胞的MMP。肝線粒體鈣的釋放以Calc

6、ium Green5N作為探針，通過(guò)熒光分光光度計(jì)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。ATP的含量使用ATP檢測(cè)試劑盒測(cè)定。鈣離子誘導(dǎo)的線粒體腫脹和線粒體在低滲性醋酸鉀中的腫脹通過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)540 nm吸光度的變化來(lái)分析。利用臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞存活率。細(xì)胞凋亡和壞死利用Annexin V/PI雙染染色試劑盒通過(guò)流式細(xì)胞儀來(lái)評(píng)估。肝細(xì)胞線粒體和HepG2細(xì)胞細(xì)胞色素c的釋放通過(guò)Western blot法檢測(cè)。HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗量采用葡萄糖檢測(cè)試劑

7、盒（葡萄糖氧化酶法）測(cè)定。
　　利用差速離心法分離小鼠肝線粒體。線粒體經(jīng)M-PER裂解后，和不同濃度的AA在30℃條件下孵育，然后制備DARTS樣品。樣品進(jìn)行SDS-PAGE分離后利用銀染進(jìn)行分析。差異條帶切膠回收，用蛋白質(zhì)譜分析目的條帶，質(zhì)譜測(cè)試原始文件用BioworksBrowser3.3軟件通過(guò)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)確定目標(biāo)蛋白。用Western blot驗(yàn)證靶點(diǎn)蛋白。原代培養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞，利用不同濃度的AA處理3小時(shí)，MTT法檢測(cè)細(xì)

8、胞活力，通過(guò)試劑盒測(cè)定肝細(xì)胞的氨消耗和尿素生成量。
　　結(jié)果：
　　大鼠肝I/R誘導(dǎo)了明顯的肝損傷，包括血清中AST和TNF-α的釋放增加，肝組織細(xì)胞壞死，標(biāo)志組織氧化損傷的MDA水平上升，SOD和過(guò)氧化氫酶的活性下降。50 mg/kg劑量AA處理可顯著減輕大鼠肝I/R引起的肝損傷，抑制AST和TNF-α的釋放，肝細(xì)胞壞死明顯減輕。另外，AA還能明顯抑制肝I/R誘導(dǎo)的MDA的生成，顯著提高肝組織SOD和過(guò)氧化氫酶的活性，表明

9、AA能通過(guò)減輕氧化應(yīng)激而改善I/R誘導(dǎo)的肝損傷。在對(duì)分離的各組大鼠肝線粒體的研究中發(fā)現(xiàn)，肝I/R誘導(dǎo)了明顯的線粒體損傷，表現(xiàn)為呼吸功能嚴(yán)重受損，MMP下降，ATP合成障礙。I/R組大鼠肝線粒體三態(tài)呼吸速率下降，四態(tài)呼吸速率上升，RCR（Respiratory control ratio,RCR）和ADP/O值均明顯降低。另外，I/R組大鼠肝線粒體發(fā)生明顯的氧化損傷，表現(xiàn)為線粒體的MDA水平上升。50 mg/kg劑量AA能明顯對(duì)抗肝I/R

10、誘導(dǎo)的肝線粒體損傷，保護(hù)MMP，改善呼吸作用，促進(jìn)ATP合成。另外，AA給藥顯著降低了肝線粒體的MDA水平，提示AA的保護(hù)作用和減輕I/R誘導(dǎo)的線粒體氧化損傷有關(guān)。在對(duì)正常大鼠肝線粒體呼吸作用的研究中發(fā)現(xiàn)，無(wú)論添加魚(yú)藤酮與否，AA都能劑量依賴性的抑制以琥珀酸鹽為底物的線粒體呼吸產(chǎn)生的ROS。特別是當(dāng)體系中不含魚(yú)藤酮時(shí)，ROS的生成明顯增加，但AA的抑制活性也顯著增強(qiáng)。這說(shuō)明AA能夠有效的抑制由于RET在線粒體復(fù)合物I上產(chǎn)生的大量ROS。

11、另外，本研究成功制備了離體大鼠肝線粒體A/R損傷模型，發(fā)現(xiàn)線粒體A/R會(huì)導(dǎo)致線粒體功能受損，表現(xiàn)為三態(tài)呼吸速率下降，四態(tài)呼吸速率上升，RCR和ADP/O值均明顯降低。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用谷氨酸鹽和蘋(píng)果酸鹽作為底物時(shí)相比琥珀酸鹽（添加魚(yú)藤酮），線粒體的損傷更加嚴(yán)重，ROS生成也明顯增加，這可能和體系中存在復(fù)合物Ⅱ到復(fù)合物Ⅰ的RET有關(guān)。AA對(duì)谷氨酸鹽和蘋(píng)果酸鹽作為底物時(shí)離體肝線粒體A/R損傷的保護(hù)作用更為明顯，表現(xiàn)為提高三態(tài)呼吸速率，降

12、低四態(tài)呼吸速率，RCR和ADP/O值均明顯上升。
　　分離的小鼠腦線粒體經(jīng)過(guò)AA處理后，以琥珀酸鹽為底物的線粒體四態(tài)呼吸速率明顯提高，RCR值降低。AA還能誘導(dǎo)腦線粒體MMP的下降，有一定的劑量依賴性。此外，鈣離子誘導(dǎo)的腦線粒體腫脹也能被AA所抑制。AA處理離體小鼠肝線粒體，能夠顯著刺激以琥珀酸鹽為底物的四態(tài)呼吸速率，導(dǎo)致RCR值下降，降低MMP和ATP水平，誘導(dǎo)線粒體鈣離子的釋放。高濃度的AA能夠使線粒體中ATP的含量明顯下降，

13、并促進(jìn)細(xì)胞色素c的釋放。此外，AA對(duì)小鼠腦和肝線粒體線粒體呼吸產(chǎn)生的ROS也有顯著的抑制作用。上述結(jié)果表明，AA能直接作用于線粒體，并且是一種線粒體解偶聯(lián)劑。本研究還發(fā)現(xiàn)AA雖然能抑制鈣離子誘導(dǎo)的線粒體腫脹，但是和經(jīng)典的質(zhì)子型解偶聯(lián)FCCP相比，AA不能誘導(dǎo)線粒體在低滲性醋酸鉀中的腫脹。質(zhì)子型解偶聯(lián)劑的抑制劑6Kch也對(duì)AA誘導(dǎo)的解偶聯(lián)作用沒(méi)有明顯影響。另外，AA誘導(dǎo)的MMP的下降和鈣離子的釋放是個(gè)緩慢的過(guò)程，這和強(qiáng)解偶聯(lián)劑FCCP誘導(dǎo)

14、的瞬時(shí)的強(qiáng)烈反應(yīng)明顯不同，表明AA是一種溫和的非質(zhì)子型解偶聯(lián)劑。高劑量的AA可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞MMP的快速下降、ATP的耗竭和細(xì)胞色素c從線粒體釋放到胞漿中，從而誘導(dǎo)細(xì)胞快速死亡；低劑量的AA能夠促進(jìn)HepG2細(xì)胞的呼吸耗氧和葡萄糖攝取，提示AA在細(xì)胞水平的解偶聯(lián)作用。通過(guò)二磷酸鳥(niǎo)苷（Guanosine diphosphate,GDP）抑制解偶聯(lián)蛋白（Uncoupling protein,UCP）或通過(guò)蒼術(shù)苷（Carboxyatrac

15、tyloside,Catr）抑制腺嘌呤核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（Adenine nucleotide transporter,ANT）可減弱AA對(duì)線粒體呼吸、MMP、線粒體鈣離子釋放和HepG2細(xì)胞死亡的影響。當(dāng)兩種抑制劑聯(lián)合使用，AA介導(dǎo)的解偶聯(lián)作用明顯減輕。
　　小鼠肝線粒體溫和裂解物和AA在30℃條件下共孵育后，制備了DARTS樣品。樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后銀染，結(jié)果顯示，在130 kD和170 kD之間有一蛋白條帶明顯受到了AA的

16、保護(hù)，顯示出對(duì)Pronase酶水解抗性。用蛋白質(zhì)譜對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氨甲酰磷酸合成酶1（Carbamyl phosphate synthetase,CPS1）可能是AA的直接作用靶點(diǎn)。通過(guò)Western blot證實(shí)CPS1是AA作用于小鼠肝線粒體的直接靶點(diǎn)。當(dāng)原代培養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞用不同濃度的AA處理后發(fā)現(xiàn)，AA能夠使肝細(xì)胞的氨解毒能力下降，尿素的產(chǎn)生減少，表明AA可以和CPS1結(jié)合，抑制其活性，從而抑制肝細(xì)胞的尿素循環(huán)。

17、
　　結(jié)論：
　　肝I/R能夠誘導(dǎo)肝線粒體嚴(yán)重的氧化應(yīng)激損傷，線粒體功能發(fā)生明顯障礙。AA可以通過(guò)保護(hù)線粒體功能對(duì)抗肝組織損傷。另外，AA可以直接作用于線粒體，是一種新型的線粒體解偶聯(lián)劑。AA能通過(guò)抑制RET誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，減輕肝I/R誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，有效保護(hù)線粒體功能。AA的解偶聯(lián)活性和UCP和ANT的激活有關(guān)。高濃度的AA能夠完全解偶聯(lián)線粒體，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的死亡。另外，AA屬于溫和的解偶聯(lián)劑，能夠在低濃度條件