EP4受體介導(dǎo)的肝缺血再灌注時(shí)線粒體保護(hù)效應(yīng)及機(jī)制研究.pdf

1、缺血再灌注(I/R)損傷是臨床常見(jiàn)的病理現(xiàn)象，創(chuàng)傷與失血性休克、冠脈缺血和體外循環(huán)手術(shù)以及器官移植手術(shù)時(shí)I/R損傷不可避免，重者可影響患者預(yù)后。I/R損傷機(jī)制復(fù)雜，其發(fā)生機(jī)理仍不完全清楚，目前認(rèn)為主要涉及氧自由基和活性氧(Reactiveoxygen species，ROS)的大量產(chǎn)生、炎性損傷以及微循環(huán)障礙等過(guò)程，而啟動(dòng)這些環(huán)節(jié)的關(guān)鍵是細(xì)胞能量代謝障礙。線粒體作為細(xì)胞氧化磷酸化的重要細(xì)胞器，其功能改變與I/R損傷密切相關(guān)。
　　

2、前列腺素E2(PGE2)是生物體內(nèi)重要的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子。I/R損傷時(shí)，PGE2對(duì)肝臟組織的炎性反應(yīng)和微循環(huán)灌注起到重要的調(diào)節(jié)作用。環(huán)氧化酶-2(COX-2)是調(diào)控體內(nèi)PGE2生成的重要限速酶，已有研究證明COX-2在肝I/R損傷中發(fā)揮重要作用。課題組前期發(fā)現(xiàn)抑制COX-2能激活一種細(xì)胞內(nèi)保護(hù)機(jī)制，即抑制線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)開(kāi)放，減輕I/R損傷，但其具體分子機(jī)制并不完全清楚。PGE2在細(xì)胞膜上存在4種G蛋白偶聯(lián)受體，即前列腺素

3、E2受體1、2、3和4(PGE2 receptor1，2，3和4，EP1，2，3，4)。作為COX-2下游重要的G蛋白偶聯(lián)受體，已有研究證實(shí)EP4在I/R時(shí)直接介導(dǎo)了PGE2的肝臟保護(hù)效應(yīng)。但是，EP4信號(hào)與對(duì)再灌注時(shí)線粒體功能的影響并不清楚。
　　目的:
　　本課題通過(guò)70％大鼠肝臟熱I/R損傷模型，研究了EP4信號(hào)在肝臟I/R損傷中的作用和機(jī)制。采用可逆性的肝血管阻斷法建立穩(wěn)定、可靠的Sprague Dawley(SD)

4、大鼠70％肝熱缺血再灌注模型，通過(guò)血清酶學(xué)檢測(cè)、組織病理學(xué)觀察、熒光分子探針測(cè)定線粒體鈣容納力（mitochondria calcium capacity, CRC）以及免疫印跡檢測(cè)線粒體相關(guān)信號(hào)通路來(lái)研究EP4激動(dòng)劑對(duì)肝I/R時(shí)的線粒體保護(hù)效應(yīng)及分子機(jī)制。
　　方法:
　　將雄性Sprague Dawley(SD)大鼠（200g-230g）隨機(jī)化分組:
　　1.假手術(shù)組（Sham組）:只打開(kāi)其腹腔，分離血管，不給予夾

5、閉缺血;
　　2.缺血再灌注組（I/R組）:采用經(jīng)典的、可逆性的肝血管阻斷法建立穩(wěn)定、可靠的SD大鼠70％肝熱缺血再灌注模型，夾閉肝左葉和肝中葉血管系統(tǒng)，形成肝臟中葉和左葉缺血，松開(kāi)血管夾行再灌注;
　　3.I/R+缺血預(yù)處理(IPC)組:于缺血前給予一次10min的短暫缺血，然后再灌注10min+70％肝臟熱缺血60min再灌注;
　　4.I/R+COX-2抑制劑NS-398(NS-398)預(yù)處理組:缺血前10min

6、腹腔給予COX-2抑制劑NS-398(30mg/kg)+70％肝臟熱缺血60min再灌注;
　　5.I/R+EP4激動(dòng)劑CAY10598(CAY)處理組:70％肝臟熱缺血60min再灌注+于缺血前1.5h、缺血30min和再灌注即刻分三次腹腔內(nèi)注射總劑量1mg/kg EP4激動(dòng)劑CAY10598;
　　6.I/R+CAY+CarboxyAtractyloside(CATR)組:70％肝臟熱缺血60min再灌注+于缺血前1.5

7、h、缺血30min和再灌注即刻分三次腹腔內(nèi)注射總劑量1mg/kg EP4激動(dòng)劑CAY10598+缺血30min前腹腔注射5mg/kg線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放劑Carboxyatractyloside。
　　于再灌注2h和6h，取肝組織和血清。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase ChainReaction，PCR)及Western Blot檢測(cè)肝臟I/R損傷后不同時(shí)間點(diǎn)EP4受體的表達(dá)情況;行血清酶學(xué)、組織病理學(xué)監(jiān)測(cè)肝損傷、熒

8、光免疫法測(cè)定線粒體鈣容納力(CRC);信號(hào)機(jī)制研究方面采用ELISA法檢測(cè)肝組織環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和組織活性氧(ROS)水平;運(yùn)用Western blot技術(shù)檢測(cè)各組肝組織GSK-3β、p-GSK-3β、ERK1/2、p-ERK1/2、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.PCR和Real Time-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常肝組織EP1、EP2、EP3和EP4基因均有不同程度的

9、表達(dá)，而與sham組比較，I/R后2h肝組織EP1、EP2和EP4受體的mRNA表達(dá)均明顯升高。IPC能明顯下調(diào)EP2和EP4受體的基因表達(dá)，而使用COX-2抑制劑NS-398預(yù)處理能下調(diào)EP4受體的基因表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示，與Sham組比較，I/R能顯著促進(jìn)再灌注2h和6h肝組織EP4蛋白表達(dá)(P＜0.05)，而NS-398則能明顯抑制該作用(P＜0.05)。
　　2.再灌注時(shí)檢測(cè)血清AST和ALT水平，結(jié)果顯

10、示:I/R時(shí)血清AST和ALT水平顯著升高，CAY預(yù)處理能明顯降低再灌注2h和6h血清AST和ALT水平(P＜0.05)。再灌注6h肝組織H-E染色和TUNEL染色結(jié)果顯示，再灌注6h I/R組肝細(xì)胞損傷明顯，CAY能明顯減輕肝細(xì)胞壞死，減少凋亡指數(shù)(P＜0.05)，提供肝保護(hù)。而MPTP開(kāi)放劑CATR能顯著逆轉(zhuǎn)CAY的保護(hù)作用。透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn):CAY能減少再灌注2h肝細(xì)胞核固縮溶解，線粒體等細(xì)胞器形態(tài)明顯改善。差速離心

11、法制備再灌注2h和6h線粒體，使用Flex StationⅡ熒光分析儀測(cè)定各組線粒體鈣容納力(CRC)顯示:與I/R組比較，再灌注2h和6 h CAY預(yù)處理能顯著增加線粒體CRC，抑制MPTP開(kāi)放，而CATR則能顯著逆轉(zhuǎn)CAY的作用(P＜0.05)。
　　3.再灌注6h肝組織cAMP和ROS水平檢測(cè)顯示:I/R能誘導(dǎo)肝組織cAMP和ROS水平明顯升高(P＜0.01)，與I/R組比較，CAY預(yù)處理能進(jìn)一步促進(jìn)肝組織cAMP濃度升高(

12、P＜0.01)，降低ROS水平(P＜0.05)。Western blot結(jié)果顯示:再灌注2h和6h I/R組肝組織p-ERK1/2表達(dá)明顯升高，CAY處理能進(jìn)一步增加肝組織p-ERK1/2表達(dá)(P＜0.05);再灌注2h I/R、I/R+CAY和I/R+CAY+CATR組肝組織p-GSK-3β表達(dá)均有不同程度升高，至再灌注6h各組p-GSK-3β表達(dá)呈下降趨勢(shì)，與I/R組和I/R+CAY+CATR組比較，CAY能增加再灌注6h肝組織p-

13、GSK-3β表達(dá)(P＜0.05);再灌注2h和6h，I/R、I/R+CAY和I/R+CAY+CATR組p-JAK2表達(dá)均有不同程度升高，其中2h升高最為顯著，與I/R組比較，CAY能抑制再灌注時(shí)肝組織p-JAK2的表達(dá)(P＜0.05);再灌注2h和6h，I/R和I/R+CAY+CATR組p-STAT3表達(dá)均顯著升高，而CAY組再灌注2h p-STAT3表達(dá)與sham和I/R組比較呈顯著下降，至6h時(shí)逐漸升高(P＜0.05)，提示CAY能

14、延緩再灌注時(shí)肝組織p-STAT3的表達(dá)升高。
　　結(jié)論:
　　1.作為COX-2信號(hào)下游重要位點(diǎn)，EP4直接參與了肝臟I/R損傷的病理過(guò)程。
　　2.使用EP4激動(dòng)劑CAY10598預(yù)處理激活EP4信號(hào)，能抑制再灌注時(shí)MPTP開(kāi)放，減輕線粒體損傷，減少肝細(xì)胞壞死和凋亡。
　　3.EP4可通過(guò)下游cAMP-ERK1/2信號(hào)進(jìn)一步影響MPTP調(diào)控相關(guān)的GSK-3β和JAK2-STAT3信號(hào)改變，從而調(diào)控MPTP通透性