骨肉瘤干細胞的分選及惡性表型的鑒定.pdf

1、研究背景:
　　根據腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)理論，腫瘤實體由大量的具有異質性、異構的細胞群構成。腫瘤干細胞是頂層次結構的亞群，通過對稱和不對稱的分裂實現(xiàn)腫瘤實體的增加，干細胞能夠自我更新和產生其余的腫瘤細胞。與正常人體干細胞不同的是，腫瘤干細胞的擴散、增殖是失控的。與正常人體干細胞相同的是，它維持基因組的完整性、具有自我更新能力、多向分化潛能。
　　隨著腫瘤干細胞理論的提出，生物醫(yī)學方面的研

2、究人員相繼從白血病、肺癌、腦腫瘤、結腸腫瘤、肝癌等多個惡性腫瘤中分選出了腫瘤干細胞，并在腫瘤干細胞的生物學性狀描述上做了大量工作。隨著研究的深入，逐漸發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞所具有的獨特生物學特性，并發(fā)現(xiàn)其在腫瘤發(fā)生、惡性生長、轉移、耐藥等多個方面扮演著重要角色。
　　在骨肉瘤的相關研究中，國內外學者相繼從骨肉瘤MG-63、U2OS細胞株中分選出腫瘤干細胞，并進行了一定程度的生物學研究，發(fā)現(xiàn)了其CSCs在細胞表面標記、生長方式、生物學性能等

3、方面與非CSCs的差異，提示骨肉瘤和其他腫瘤一樣，同樣存在CSCs。然而，作為骨肉瘤家族中惡性程度高（高成瘤、高轉移率）的骨肉瘤143-B細胞株，卻未見相關報道。
　　為了進一步研究骨肉瘤CSCs的生物學性能，我們以骨肉瘤143-B細胞株為研究對象，對其進行CSCs的分選，并觀察其生物學特性。
　　第一部分 有限稀釋法分選骨肉瘤143-B干細胞
　　目的:
　　探索骨肉瘤干細胞的分選方法，為進一步研究骨肉瘤的生物

4、學特性打下基礎。
　　方法:
　　購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心的143-B細胞株進行常規(guī)培養(yǎng)、傳代，取生長良好的細胞進行軟瓊脂克隆分選、SP分選、有限稀釋法分選，將分選出的細胞進行擴增、傳代，同樣傳至第二代后提取RNA并進行相對定量PCR比較其干性因子Nanog、OCT4的表達。
　　結果:
　　軟瓊脂克隆法分選出的細胞在Nanog、 OCT4的表達上與親代細胞143-B無顯著差異。有限稀釋法及SP分選法分選出的細

5、胞在Nanog、OCT4的表達上高于親代細胞143-B并差異顯著，而有限稀釋法與SP法分選出的細胞兩者之間無明顯差異。
　　結論:
　　有限稀釋法可有效分選出腫瘤干細胞，并且在Nanog、OCT4的表達上與SP分選法分選出的腫瘤干細胞無顯著差異。
　　第二部分 143-B細胞株干細胞的生物學性能
　　目的:
　　探索骨肉瘤143-B細胞株干細胞的生物學性能，進一步了解骨肉瘤并為治療骨肉瘤、提高骨肉瘤患者的生

6、活質量、生存時間提供初步實驗依據。
　　方法:
　　1、成球試驗
　　收集143-B、143-L（有限稀釋法所得到的骨肉瘤143-B細胞株干細胞）二組細胞，并計數(shù)，按照一定濃度接種在無血清軟瓊脂孔板中，觀察細胞球形成。
　　2、蛋白印跡法(Western-Blot)分析
　　收集143-B、143-L、143-SP（SP分選法分選骨肉瘤143-B細胞株所得到的腫瘤干細胞）三組細胞，并裂解三組細胞提取總蛋白，

7、以BCA蛋白濃度測定試劑盒測定三組細胞的總蛋白濃度，Western-Blot檢測三組細胞中Nanog、OCT4的表達情況并進行比較。
　　3、免疫熒光法檢測細胞干性標志物表達
　　將143-B、143-L細胞以相同濃度接種在爬片上，待細胞生長至鋪滿爬片60％左右面積時，給予4％多聚甲醛固定，進行免疫熒光檢測Nanog、OCT4在143-B、143-L中的表達情況并進行比較。
　　4、細胞多向分化潛能潛能的檢測
　

8、　收集143-B、143-L細胞并計數(shù)，以相同濃度接種在12孔孔板中，分別進行成骨誘導分化試驗、成脂、成軟骨誘導分化試驗，觀察兩組細胞在成骨分化、成脂、成軟骨分化的能力并進行比較。
　　5、細胞耐藥能力（順鉑、阿霉素）的檢測
　　收集143-B及143-L細胞，以相同濃度將細胞接種在96孔細胞培養(yǎng)板內，次日換液后加入含有不同濃度順鉑的培養(yǎng)基，24小時后加入細胞計數(shù)試劑盒-8(cell countingkit-8，CCK-8)

9、試劑并在酶標儀上測定96孔細胞培養(yǎng)板每孔在450nm處的吸光度(D)值，根據吸光度(D)值及添加的順鉑濃度繪制耐藥曲線，并在耐藥曲線上標出順鉑對該細胞的半數(shù)抑制濃度(half inhibitory concentration IC50)。并比較細胞存活數(shù)量，進而比較其對順鉑的耐藥能力。
　　6、動物成瘤試驗比較兩組細胞在裸鼠體內的成瘤能力
　　將體重、周齡無顯著差異的18只裸鼠隨機分為6組，143-B及143-L細胞各按照三

10、個劑量組(1×106、1×105、1×104)，每個劑量組皮下注射三只裸鼠，定期測量瘤體生長情況及裸鼠體重變化情況，并將兩組細胞相同劑量進行比較。
　　7、統(tǒng)計學處理
　　應用SPSS17.0軟件對所得數(shù)據進行處理，確定試驗所得結果統(tǒng)計學上有意義。
　　結果:
　　1、143-L具有較143-B更強的成球能力。結果具有統(tǒng)計學意義。
　　2、143-L、143-SP較143-B具有更高的Nanog、OCT4蛋

11、白表達。143-L與143-SP在Nanog、OCT4蛋白表達上兩者之間無顯著差異。免疫熒光檢測Nanog、OCT4表達，143-L較143-B同樣顯著增高。結果具有統(tǒng)計學意義。
　　3、在相同的誘導分化條件下，143-L細胞具有較強的向成骨細胞分化的能力，143-B細胞向成骨分化能力較弱;143-L細胞具有較強的向脂肪細胞分化能力，143-B不能向脂肪細胞分化;143-L具有向軟骨細胞分化的能力，143-B細胞在誘導階段即不能形

12、成細胞團塊。
　　4、順鉑對143-B的半數(shù)抑制濃度約為0.83ug/mL，對143-L的半數(shù)抑制濃度約為2.51ug/mL。表明143-L較143-B具有更強的對順鉑耐藥能力。阿霉素對143-B的半數(shù)抑制濃度約為0.11 ug/mL，對143-L的半數(shù)抑制濃度約為0.25ug/mL。表明143-L較143-B具有更強的對順鉑、阿霉素耐藥能力。
　　5、143-L及143-B兩組細胞經過接種在裸鼠體內5周后，143-L細胞在