轉(zhuǎn)錄共激活因子4對骨肉瘤惡性表型的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　探索PC4對骨肉瘤惡性表型的影響及其可能的分子機(jī)制。
　　首先，在前期研究基礎(chǔ)上探索PC4蛋白表達(dá)量與臨床骨肉瘤分期、預(yù)后的聯(lián)系。
　　然后，在多種不同惡性程度的骨肉瘤細(xì)胞模型中檢測PC4的表達(dá)情況。在高肺轉(zhuǎn)移骨肉瘤細(xì)胞株143B中使用慢病毒干擾PC4的表達(dá)，檢測惡性表型的變化，分析PC4可能參與哪些惡性表型的調(diào)控。
　　針對骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移表型，通過篩選分析RNA-seq結(jié)果，剖析PC4對MMP9的具體

2、調(diào)控機(jī)制。
　　針對骨肉瘤骨破壞表型，通過篩選分析RNA-seq結(jié)果，剖析PC4參與骨肉瘤骨破壞的具體分子機(jī)制及可能存在的靶基因。
　　方法:
　　1.PC4蛋白表達(dá)量與臨床骨肉瘤分期、預(yù)后的聯(lián)系。
　　1.1 使用免疫組織化學(xué)法分析198例骨肉瘤臨床標(biāo)本和44例正常骨組織中PC4的表達(dá)量與年齡、性別、Enneking分期、腫瘤大小之間的關(guān)系，并對免疫組化結(jié)果進(jìn)行量化評估。
　　1.2 使用WB法分析5例骨

3、肉瘤臨床標(biāo)本和對應(yīng)正常癌旁組織中PC4的表達(dá)量，分析PC4在骨肉瘤組織和正常組織中存在差異表達(dá)。
　　1.3 隨訪59例骨肉瘤病例，分析PC4的表達(dá)情況與患者生存時間之間的關(guān)系，繪制生存曲線。
　　2.通過細(xì)胞模型和裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)，在多種不同惡性程度的骨肉瘤細(xì)胞株中檢測PC4的表達(dá)情況。分析PC4可能參與的骨肉瘤惡性表型調(diào)控。
　　2.1 分析PC4在7種惡性程度不同的骨肉瘤細(xì)胞株中的蛋白表達(dá)情況。
　　2.2 雙

4、層軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)檢測7種骨肉瘤細(xì)胞的基礎(chǔ)克隆形成能力。
　　2.3 裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)檢測多種骨肉瘤細(xì)胞的成瘤能力。
　　2.4 使用RT-PCR法在多種骨肉瘤細(xì)胞株中檢測惡性表型相關(guān)基因的表達(dá)情況。
　　2.5 在143B高肺轉(zhuǎn)移骨肉瘤細(xì)胞株中使用慢病毒干擾PC4的表達(dá)。
　　3.使用RNA-seq的高通量測序法，分析143B細(xì)胞株在干擾PC4后基因表達(dá)的變化情況。
　　3.1 分析143B細(xì)胞株在干擾PC4后

5、存在差異表達(dá)的基因。
　　3.2 使用Gene ontology分析差異表達(dá)基因在不同細(xì)胞功能、細(xì)胞組成、生物學(xué)功能中的富集程度，探尋差異表達(dá)基因可能的效應(yīng)。
　　3.3 使用KEGG pathway分析差異表達(dá)基因在不同信號通路中的富集程度，探尋差異表達(dá)基因可能的參與的信號通路。
　　4.針對骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移表型，基于RNA-seq結(jié)果，剖析PC4參與MMP9的調(diào)控進(jìn)而影響骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移能力的機(jī)制。
　　4.1 使用

6、PC4干擾慢病毒在7種骨肉瘤細(xì)胞株中驗(yàn)證慢病毒干擾效率;RT-PCR法檢測7種骨肉瘤細(xì)胞株在PC4干擾后MMP-2、MMP-9、FN基因RNA水平的變化情況。
　　4.2 使用外源性人重組FN蛋白和FNsiRNA分別在143B和MG63兩種細(xì)胞模型中驗(yàn)證FN對MMP-2和MMP-9的調(diào)控作用。
　　4.3 使用染色質(zhì)免疫共沉淀法分析PC4與MMP-9啟動子區(qū)域的結(jié)合能力。
　　4.4 使用熒光素梅報告基因和PC4siR

7、NA及SP1 siRNA，檢測PC4和SP1對MMP-9基因轉(zhuǎn)錄激活能力。
　　4.5 免疫共沉淀法分析143B細(xì)胞中PC4蛋白與SP1蛋白的結(jié)合能力。
　　5.針對骨肉瘤骨破壞表型，基于對RNA-seq結(jié)果的分析，剖析PC4參與骨肉瘤骨破壞的具體分子機(jī)制及可能存在的靶基因。
　　5.1 裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)檢測PC4干擾前后143B細(xì)胞對骨破壞的影響。
　　5.1.1 Micro CT檢測病理性骨折的發(fā)生率、骨小梁數(shù)量

8、、骨小梁厚度、骨量的變化。
　　5.1.2分別在共培養(yǎng)細(xì)胞模型和條件培養(yǎng)基細(xì)胞模型中檢測PC4干擾143B細(xì)胞對RAW264.7破骨分化的影響。使用TRAP染色和骨片掃描電鏡評估破骨細(xì)胞成熟程度。
　　5.1.3分析RNA-seq結(jié)果，篩選與破骨細(xì)胞活化相關(guān)的分泌型細(xì)胞因子，并使用RT-PCR法驗(yàn)證RNA-seq結(jié)果。
　　5.1.4使用WB法驗(yàn)證IGFBP5在PC4干擾前后的蛋白表達(dá)情況。
　　5.1.5使用外

9、源性IGFBP5蛋白，檢測其對RAW264.7破骨分化的影響，使用TRAP染色評估破骨細(xì)胞成熟程度。
　　5.1.6使用外源性IGFBP5蛋白，在條件培養(yǎng)基細(xì)胞模型中檢測PC4干擾及外源性IGFBP5對RAW264.7破骨分化的影響，使用TRAP染色評估破骨細(xì)胞成熟程度。
　　結(jié)果:
　　1.PC4蛋白表達(dá)量與臨床骨肉瘤分級、分期、預(yù)后的聯(lián)系。
　　1.1 PC4主要在細(xì)胞核表達(dá)，在高分期的骨肉瘤標(biāo)本中表達(dá)較高，

10、PC4的表達(dá)與骨肉瘤的患者的性別、年齡無關(guān)，與腫瘤的大小以及腫瘤的Ennenking分期相關(guān)。
　　1.2 WB法檢測結(jié)果提示PC4在骨肉瘤組織和配對的正常組織中存在差異表達(dá)，在骨肉瘤組織中高表達(dá)。
　　1.3 隨訪59例骨肉瘤病例，生存曲線分析結(jié)果提示:PC4的陽性率與患者生存時間負(fù)相關(guān)。
　　2.通過細(xì)胞模型和裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)，在多種不同惡性程度的骨肉瘤細(xì)胞株中檢測PC4的表達(dá)情況。PC4參與多種骨肉瘤惡性表型調(diào)控。<

11、br>　　2.1 PC4在7種惡性程度不同的骨肉瘤細(xì)胞株中的蛋白表達(dá)情況。
　　2.2 雙層軟瓊脂克隆實(shí)驗(yàn)檢測7種骨肉瘤細(xì)胞的基礎(chǔ)克隆形成能力:克隆形成能力由強(qiáng)到弱依次為:143B、MNNG-HOS、MG-63、9901、HOS、SAOS2、U2OS。
　　2.3 裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)檢測多種骨肉瘤細(xì)胞的成瘤能力:，143B和MNNG-HOS擁有最強(qiáng)的成瘤能力，9901次之，MG-63較弱，HOS在觀察期內(nèi)未成瘤。
　　2.4

12、 使用RT-PCR法在多種骨肉瘤細(xì)胞株中檢測惡性表型相關(guān)基因的表達(dá)情況:PC4在143B、MNNG-HOS、U2OS表達(dá)較高，HOS表達(dá)最弱;而MMP9在143B中表達(dá)異常增高，其余骨肉瘤細(xì)胞株中表達(dá)相對弱。143B的MTA1表達(dá)最高，MNNG-HOS次之，其余細(xì)胞株表達(dá)較弱。143B中P53幾乎測不到表達(dá)，而HOS和U2OS相對表達(dá)最高。
　　2.5 在143B高肺轉(zhuǎn)移骨肉瘤細(xì)胞株中使用慢病毒干擾PC4的表達(dá)。
　　3.R

13、NA-seq的高通量測序法，分析143B細(xì)胞株在干擾PC4后基因表達(dá)的變化情況。
　　3.1 在143B細(xì)胞株中干擾PC4后，513個基因出現(xiàn)下調(diào)，571個基因上調(diào)。
　　3.2 Gene ontology分析結(jié)果提示:PC4干擾后的差異表達(dá)基因可能參與了蛋白粘附、細(xì)胞連接、細(xì)胞外基質(zhì)的分泌、細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞應(yīng)激等多種細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)。
　　3.3 KEGG pathway分析結(jié)果提示:PC4干擾后的差異表達(dá)基因在p

14、53等20條信號通路中呈現(xiàn)富集狀態(tài)。
　　4.PC4參與MMP9的調(diào)控進(jìn)而影響骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移能力。
　　4.1 PC4干擾慢病毒在7種骨肉瘤細(xì)胞株中均有干擾效果;PC4干擾后MMP-2、MMP-9、FN基因RNA水平除個別細(xì)胞株外均有不同程度的下調(diào)。
　　4.2 外源性人重組FN蛋白和FNsiRNA對MG63細(xì)胞的MMP-2和MMP-9均有明顯調(diào)控作用，但是對143B和143BPC4-細(xì)胞的MMP-2和MMP-9沒有明顯

15、的調(diào)控作用。
　　4.3 染色質(zhì)免疫共沉淀法結(jié)果提示:PC4蛋白可以與MMP-9啟動子區(qū)域結(jié)合。
　　4.4 熒光素梅報告基因結(jié)果提示:PC4siRNA及SP1 siRNA均可降低MMP-9的轉(zhuǎn)錄活性，二者存在協(xié)同效應(yīng)。
　　4.5 免疫共沉淀法結(jié)果提示:143B細(xì)胞中PC4蛋白與SP1蛋白可以結(jié)合。
　　5.PC4參與骨肉瘤骨破壞的具體分子機(jī)制及可能存在的靶基因。
　　5.1 裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)檢測PC4干擾前

16、后143B細(xì)胞對骨破壞的影響。
　　5.1.1 Micro CT檢測結(jié)果提示:PC4干擾組的裸鼠病理性骨折的發(fā)生率明顯降低、骨小梁數(shù)量增加、骨小梁厚度增厚、骨量增加。
　　5.1.2 共培養(yǎng)細(xì)胞模型和條件培養(yǎng)基細(xì)胞模型均提示:骨肉瘤細(xì)胞可以促進(jìn)RAW264.7的破骨分化，PC4干擾可抑制該效應(yīng)。
　　5.1.3 RNA-seq結(jié)果提示:在PC4干擾后CXCL2、IGFBP5、MCP1、IL1A、IL1B明顯下調(diào)，RT-

17、PCR法驗(yàn)證結(jié)果與RNA-seq結(jié)果一致。
　　5.1.4 WB法檢測IGFBP5在PC4干擾后的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。
　　5.1.5 外源性IGFBP5蛋白，可增加TRAP陽性細(xì)胞的數(shù)量，且該效應(yīng)呈濃度依賴性。
　　5.1.6 外源性IGFBP5蛋白在條件培養(yǎng)基細(xì)胞模型中，可部分抵消PC4干擾對RAW264.7破骨分化的抑制作用。
　　結(jié)論:
　　1.PC4在骨肉瘤中高表達(dá);
　　2.PC4與骨肉瘤的

18、分期及預(yù)后存在相關(guān)性;
　　3.PC4參與調(diào)控骨肉瘤的增殖、侵襲、遷移、粘附、集落形成、成瘤、轉(zhuǎn)移等惡性表型;
　　4.PC4通過與MMP9的轉(zhuǎn)移因子SP1形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，參與MMP9的轉(zhuǎn)錄調(diào)控;
　　5.PC4的表達(dá)量與143B細(xì)胞引起的骨吸收正相關(guān);
　　6.干擾在143B骨肉瘤細(xì)胞中PC4的表達(dá)，可抑制143B分泌CXCL2、CCL2、IGFBP5、IL1A、IL1B，從而抑制破骨細(xì)胞的激活，降低骨肉瘤引起