猴結核分枝桿菌Ag85B基因的克隆、表位免疫原性初步研究以及猴結核快速鑒定方法的建立.pdf

1、目前結核分枝桿菌(Mycobacterium)仍然是嚴重危害人類健康的重要病原微生物，其每年在全球范圍內引起超過一千萬人口的感染并導致約三百萬人口的死亡。隨著近年來結核分枝桿菌耐藥株的不斷出現(xiàn)以及BCG作為目前唯一用于預防結核病的疫苗，存在免疫保護效果不穩(wěn)定；接種后使結核菌素試驗呈陽性，干擾結核病的診斷，延誤治療時機；免疫功能缺陷患者如艾滋病等接種后可能引起嚴重的散播性結核病等多方面的原因，發(fā)展更安全、高效、低成本、并可廣泛用于各類人群

2、的新型結核病疫苗已經成為結核病預防工作中的當務之急。同時，結核病也是人猴共患疾病之一，對人工飼養(yǎng)猴群的健康危害極大，人類結核病一旦感染猴群，呈爆發(fā)性疾病，可造成整個猴群的毀滅。缺乏敏感而特異的結核檢疫方法是造成實驗猴結核預防管理困難的原因之一，許多發(fā)達國家控制動物結核病的傳統(tǒng)策略“檢驗-屠宰”，在某些自然疫源再感染可能性較大的情況下是失敗的，同時帶來慘重經濟后果(隔離、活動控制、宰殺)通常是在缺少臨床體征和癥狀的情況下僅根據(jù)感染的證據(jù)(

3、如目前的實驗動物檢疫主要采用的是皮內進行結核菌素試驗)決定的，而且由于人猴交叉感染，對飼養(yǎng)員及工作人員的健康也造成威脅；除此之外，現(xiàn)有的人用卡介苗(BCG)在預防猴針對牛型和人型結核分枝桿菌感染的能力上存在很大差異，目前也尚無用于預防猴類結核病的疫苗，所以對獸用新疫苗的需要顯得更為迫竊。因此，對于人工飼養(yǎng)猴群的繁殖和管理，對防止結核病在猴群中的傳播和確保猴質量，也都亟待拓展獸類專用的疫苗和猴結核病檢測的方法。 借鑒在人結核疫苗研

4、制方面的技術和成果，致病菌中的單個或多個抗原表位能夠通過蛋白多肽或DNA疫苗的方式進行免疫從而獲得免疫保護作用，在結核分枝桿菌中理想的抗原應是在結核分枝桿菌感染初期被識別的抗原。已知人用亞單位疫苗研究中有明顯作用及部分作用的分泌型蛋白有：早期分泌性抗原靶6(ESAT6)、抗原85復合體(Ag85)、MPB64以及熱休克蛋白HSP65等，其中Ag85蛋白復合體是近年來研究的熱點。Ag85B是Ag85復合體中一種重要的分泌型蛋白，是人體抗結

5、核T細胞免疫反應的主要靶分子，這使其成為最具潛力的疫苗候選蛋白之一。在豚鼠模型中純化的Ag85B蛋白也能夠誘導持續(xù)的抗結核免疫保護，并且當使用表達分泌Ag85B蛋白的重組卡介苗免疫動物時顯示出比傳統(tǒng)的卡介苗更強大的針對結核分枝桿菌氣溶膠攻擊的保護。表位疫苗是近年發(fā)展起來的一種嶄新的免疫接種技術，以保護性抗原上的特異性表位為基礎進行疫苗分子設計，并以抗原表位為靶抗原，既能誘生特異性免疫應答，又避免了天然蛋白中抑制性抗原表位引起的免疫抑制，

6、使免疫應答具有更強的特異性和更好的免疫效果，且不存在生物危害性和遺傳變異致疫苗效力喪失等問題，因此，表位疫苗已成為研制感染性疾病和惡性腫瘤疫苗的方向。因此，借鑒表位疫苗在其它慢性感染性疾病中的研究成果，選擇在人類結核疫苗研究中具有免疫原性的抗原進行合理的表位預測，以此表位為基礎設計的疫苗由于其小分子、穩(wěn)定和結構簡單等特性，有可能打破機體產生的免疫抑制，防止自身免疫反應的發(fā)生，歸避病原體因自身快速基因突變所形成的免疫逃避作用，達到預防和治

7、療結核分枝桿菌感染的目的。 綜上，本研究擬在人用結核分枝桿菌疫苗開發(fā)研究的基礎上，利用猴結核分枝桿菌中存在的特有DNA序列嘗試開展一種適用于猴結核病鑒定的準確而便捷的檢測方法；同時，嘗試對在人體中具有免疫保護性的相應猴基因進行克隆，從而進行保護性抗原表位的尋找和免疫原性初步研究，為猴的結核病預防和猴結核表位疫苗的開發(fā)提供有益的幫助，也為人用結核表位疫苗的開發(fā)開辟新的視野。 我們首先根據(jù)本實驗室自身特點建立了一套結核分枝桿

8、菌猴鑒定的分子免疫學及細菌學基本技術，結合結核菌素實驗和猴咽拭子涂片抗酸染色技術，能夠較為準確的鑒定出野生猴來源中的攜帶結核分枝桿菌的個體，從而得以從這些個體中獲得病理組織，提取其基因組。并通過標準株H37RV的Ag85B基因序列設計了引物用于擴增野生猴來源Mycobacterium陽性猴的相應基因。Blastn分析后發(fā)現(xiàn)，Ag85B基因在結核分枝桿菌多個種內菌株，以及多個同屬不同種的菌株中高度保守，而在結核陽性猴中得到的Ag85B基因

9、也與此共同序列有99.05％的相似性。基于此序列設計的抗原多肽必然能夠起到針對多種結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌的免疫保護作用。通過生物信息學方法的合理預測，篩選了抗原表位中能夠為最多MHC分子提呈并且處于蛋白外部的序列進行人工合成，進行淋巴細胞增殖實驗和抗體測試，結果顯示此抗原表位能夠有效的引起淋巴細胞增殖，有較好的免疫原性和抗原性。 此外，鑒于猴的目前活檢猴感染結核病的檢疫方法主要為結核菌素試驗。由于檢測方法的單一性及敏感性和

10、特異性低，加之結核病的變異性大，給靈長類結核病的診斷帶來困難。本實驗采用結核分枝桿菌早期分泌蛋白ESAT-6克隆作為陽性對照而建立的鑒定方法，能夠成功從活猴外周血中檢測出ESAT-6基因的存在，從而檢測出結核猴，通過ESAT-6 PCR的方法，我們在30只PPD陰性的野生來源猴小樣本調查中鑒定出1只陽性猴，較之結核菌素測試更為簡便和靈敏，通過進一步的改進和完善，將對猴群的養(yǎng)殖和管理帶來很大的益處。 通過上述工作，本研究證實Ag8