雞志賀氏菌病平板凝集試驗(yàn)和間接ELISA診斷方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、雞志賀氏菌病是由志賀氏菌(shigella.spp)引起的一種人畜(禽)共患傳染病。該病流行廣泛,發(fā)病率高,可引起不同品種、不同日齡的雞發(fā)生痢疾,并可引起雛雞死亡。該病的傳播流行給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,同時(shí)也給人類公共衛(wèi)生安全造成了嚴(yán)重隱患。所以,對(duì)雞志賀氏菌病盡早做出準(zhǔn)確診斷以便采取有效的預(yù)防和治療措施成為控制本病的關(guān)鍵。因此,臨床上建立一種切實(shí)可行的快速診斷方法越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)養(yǎng)禽業(yè)的關(guān)注。本研究以此為出發(fā)點(diǎn),建立了診斷雞志

2、賀氏菌病的平板凝集試驗(yàn)和間接ELISA兩種血清學(xué)方法,并對(duì)兩種方法進(jìn)行了臨床應(yīng)用,旨在為雞志賀氏菌病的準(zhǔn)確快速診斷提供特異性強(qiáng)、敏感性高和經(jīng)濟(jì)實(shí)用的診斷方法,為我國(guó)雞志賀氏菌病的防控提供條件和技術(shù)支持。
　　 本課題以本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保存的雞志賀氏菌為研究材料,開展了雞志賀氏菌病平板凝集試驗(yàn)和間接ELISA兩種血清學(xué)診斷方法的研究與應(yīng)用工作。
　　 1.應(yīng)用雞志賀氏菌凝集抗原及其標(biāo)準(zhǔn)血清,對(duì)平板凝集試驗(yàn)方法的各種反應(yīng)條件

3、進(jìn)行選擇和優(yōu)化。結(jié)果顯示:凝集反應(yīng)抗原的最佳濃度為40億/mL,最佳稀釋液為0.5％的石炭酸生理鹽水,最適pH為7.2,最佳反應(yīng)溫度為20℃～35℃,最佳反應(yīng)時(shí)間為3～5min,確立了各項(xiàng)反應(yīng)條件,建立了該病的平板凝集試驗(yàn)診斷方法。結(jié)果表明,該方法具有特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確快速、簡(jiǎn)便易行等優(yōu)點(diǎn)。該血清學(xué)診斷方法的建立為雞志賀氏菌病的快速診斷提供了重要條件,對(duì)有效控制該病提供了可靠依據(jù)。
　　 2.應(yīng)用已建立的平板凝集試驗(yàn)診斷方法對(duì)采自河

4、南省不同地區(qū)的810份雞血清進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示雞鮑氏型、痢疾型志賀氏菌血清抗體陽(yáng)性率分別為31.5％和14.6％,表明雞志賀氏菌病已在河南省部分地區(qū)廣泛流行。應(yīng)用結(jié)果顯示,雞志賀氏菌平板凝集試驗(yàn)診斷方法特異性強(qiáng),重復(fù)性好,結(jié)果可靠,簡(jiǎn)便易行,對(duì)雞志賀氏菌病的臨床診斷具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
　　 3.以甲醛滅活的雞志賀氏菌全菌體作為診斷抗原,以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗雞IgG抗體為第二抗體,以TMB為顯色劑,成功建立了診斷雞志賀氏菌

5、病的間接ELISA方法。通過(guò)對(duì)間接ELISA反應(yīng)條件的一系列研究,確定了各組分的最適工作條件:所用酶標(biāo)板的變異系數(shù)為4.19％,達(dá)到ELISA的要求；雞志賀氏菌菌體抗原最適包被濃度為108cfu/mL,最適包被條件為4"C過(guò)夜；待檢血清的最佳稀釋度為1:160,與包被抗原在37℃作用1h:酶標(biāo)二抗的最適工作濃度為1:4000,血清與酶標(biāo)二抗的反應(yīng)條件為37℃1.5h,最適封閉條件為2％明膠室溫作用1.5h;底物最適反應(yīng)條件為室溫15mi

6、n；陰陽(yáng)性臨界值為0.414。經(jīng)特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn),表明建立的間接ELISA方法具有很高的特異性、敏感性和重復(fù)性,適用于雞群志賀氏菌感染抗體的診斷和檢測(cè)。
　　 4.應(yīng)用已建立的間接ELISA診斷方法對(duì)采自河南省不同地區(qū)的589份雞血清樣品進(jìn)行檢測(cè),檢出陽(yáng)性血清309份,陽(yáng)性率達(dá)52.46％,比平板凝集試驗(yàn)方法的陽(yáng)性檢出率40.75％高11.71％。結(jié)果顯示間接ELISA診斷方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高和準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn),可