RT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠自然和實(shí)驗(yàn)感染鼠諾瓦克病毒及病毒分離.pdf

1、諾瓦克病毒(Noroviruses，NVs)又稱諾如病毒或小圓結(jié)構(gòu)病毒(Smallroundstructuredvirus)，是1972年在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)的新生病毒，直到1995年國(guó)內(nèi)才有報(bào)道。NVs是一組世界范圍內(nèi)引起的急性無菌性胃腸炎的重要病原，在全球感染人的非細(xì)菌性胃腸炎疾病的病例中超過90％是由該病毒引起的。該病毒是嚴(yán)重危害人類健康的重要食源性病毒，可導(dǎo)致不同年齡階段人群的急性病毒性腹瀉。被NVs感染的食品、水源和NVs感染者排泄

2、物引起的糞口傳播是造成NVs感染的主要途徑，特點(diǎn)是發(fā)病率高、致病劑量低和對(duì)外界的抵抗力較強(qiáng)。感染的急性胃腸炎臨床癥狀主要包括:惡心、嘔吐、腹瀉、腹痛、發(fā)熱、厭食等。NVs屬于嵌杯狀病毒科的諾瓦克病毒屬，直徑約27-35nm，無囊膜，是單股正鏈RNA病毒的統(tǒng)稱。NVs基因全長(zhǎng)約7.7kb，包括3個(gè)開放閱讀框(openreadingframes，ORFs)，依次是ORF1、ORF2和ORF3。NVs可分為5個(gè)基因群(genegroup，GG

3、)，分別為GGⅠ、GGⅡ、GGⅢ、GGⅣ和GGⅤ。其中NVGGⅠ、NVGGⅡ和NVGGⅣ主要感染人類，NVGGⅢ感染牛，NVGGⅤ則感染鼠類動(dòng)物。由于NVGGⅤ只在鼠類動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，因此又被稱之為鼠諾瓦克病毒(Murinenoroviruses，MNV)。研究表明，MNV在生物學(xué)、遺傳學(xué)、分子學(xué)上的特征都與NVs一樣;病毒的大小、形狀、浮力密度、基因結(jié)構(gòu)也與NVs很相似。NVs在體外不能增值，而MNV卻可以在傳代細(xì)胞小鼠巨噬細(xì)胞系RAW

4、264.7細(xì)胞上生長(zhǎng)并產(chǎn)生細(xì)胞病變，因此MNV成為了NVs的替代病毒進(jìn)行研究，也是唯一的理想研究模型。MNV在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中廣泛傳播，幾乎所有的實(shí)驗(yàn)小鼠對(duì)此病毒易感。報(bào)道稱MNV在糞便中能存留較長(zhǎng)一段時(shí)間。因此，本研究從上海地區(qū)的實(shí)驗(yàn)小鼠中采集小鼠糞便或者盲腸內(nèi)容物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，并在RAW264.7細(xì)胞上生長(zhǎng)分離得到MNV病毒。
　　 1.為了解實(shí)驗(yàn)小鼠自然感染MNV的情況，采集送檢的80只實(shí)驗(yàn)小鼠的糞便樣本，應(yīng)用RT-PC

5、R方法擴(kuò)增糞便樣本的MNVORF2特異性基因(187bp，MNVnt5473-5659)片段。對(duì)PCR檢測(cè)為陽性的糞便樣本經(jīng)過10倍體積的PBS稀釋以后灌胃到4只ICR小鼠體內(nèi)，一周以后，將3只ICR小鼠與灌胃的小鼠同居飼養(yǎng)，觀察小鼠是否出現(xiàn)異常癥狀，定期采集糞便做RT-PCR檢測(cè)，研究小鼠實(shí)驗(yàn)感染MNV的情況。一個(gè)月以后，處死小鼠，采集糞便、盲腸、十二指腸、脾、肝、大腦、腎、肺、心臟、胸腺、子宮、卵巢和唾液腺等器官做RT-PCR檢測(cè)，

6、研究MNV的主要感染部位。結(jié)果表明:自然感染的陽性率為13.75％(11/80);實(shí)驗(yàn)感染的小鼠外表健康、活潑、沒有腹瀉現(xiàn)象，陽性率為100％;主要的感染部位為小鼠的消化系統(tǒng)。本研究是首次在上海地區(qū)實(shí)驗(yàn)小鼠糞便中檢測(cè)到MNV。
　　 2.RAW264.7細(xì)胞以5×106細(xì)胞/平板的密度培養(yǎng)在60mm的平板上，CO2孵化箱培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)，直到形成80％～90％的單層細(xì)胞。將培養(yǎng)液倒掉，500μLPCR陽性結(jié)果的糞便懸液接種到RAW