上海地區(qū)小鼠諾瓦克病毒的感染狀況及病毒的分離和表達(dá).pdf

1、小鼠諾瓦克病毒(Murine Noroviruses，MNV)屬于杯狀病毒科，諾如病毒屬，在實(shí)驗(yàn)小鼠中的自然感染率很高，最初是在免疫缺陷小鼠內(nèi)發(fā)現(xiàn)的。感染MNV后，免疫功能正常的小鼠通常無(wú)明顯癥狀，而免疫缺陷小鼠可以出現(xiàn)致死性感染。MNV具有遺傳和抗原多樣性，容易發(fā)生變異，我國(guó)關(guān)于MNV的報(bào)道還比較少，對(duì)其致病力及對(duì)實(shí)驗(yàn)研究的影響尚不完全清楚，也沒(méi)有明確的感染情況調(diào)查。
　　為了解上海地區(qū)實(shí)驗(yàn)小鼠自然感染MNV的狀況，本實(shí)驗(yàn)抽取委

2、托檢測(cè)單位送檢的319只SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)小鼠，分別采集盲腸內(nèi)容物和血清樣本，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法擴(kuò)增小鼠盲腸內(nèi)容物樣本中MNV的特異性基因片段來(lái)檢測(cè)MNV的感染狀況，同時(shí)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)與核酸檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比。MNV可以在小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，并能產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect，CPE)，

3、利用這個(gè)特性，可以將RT-PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的盲腸內(nèi)容物樣本稀釋后經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾，將濾液接種到RAW264.7細(xì)胞分離病毒，盲傳后采用RT-PCR方法鑒定。MNV是RNA病毒，基因組含有四個(gè)開放閱讀框(Open readingframes，ORFs)，其中的ORF2編碼衣殼蛋白VP1，而目前關(guān)于MNV的研究多與VP1有關(guān)，根據(jù)GenBank中登陸的國(guó)內(nèi)廣州株序列設(shè)計(jì)相關(guān)引物，擴(kuò)增分離毒株的ORF2，并進(jìn)行克隆、原核表達(dá)，觀察是

4、否有誘導(dǎo)蛋白產(chǎn)生。
　　經(jīng)RT-PCR檢測(cè)的319份小鼠盲腸內(nèi)容物樣本中，陽(yáng)性樣本95份，陽(yáng)性率為29.78％。對(duì)180份經(jīng)RT-PCR檢測(cè)的小鼠的血清樣本進(jìn)行ELISA檢測(cè)，陽(yáng)性樣本70份，陽(yáng)性率為38.89％。RAW264.7細(xì)胞盲傳5代后在24h內(nèi)出現(xiàn)CPE，72h內(nèi)病變逐漸明顯，細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)RT-PCR鑒定，凝膠電泳得到一條187bp的目的條帶，測(cè)序結(jié)果與樣本來(lái)源一致。
　　經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到分離毒株的ORF2片

5、段，測(cè)序結(jié)果為1626bp，經(jīng)NCBI的BLAST軟件分析，與登錄的MNV毒株同源性在87％以上。為得到大量穩(wěn)定的目的片段，將ORF2克隆到pMD-18T載體。目的質(zhì)粒與表達(dá)載體pET28a雙酶切后連接，將重組質(zhì)粒pET28a-ORF2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)、鎳瓊脂糖親和層析和陰離子交換層析分離純化目的蛋白，通過(guò)SDS-PAGE電泳判斷目的蛋白分子質(zhì)量約60 KD。
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)核酸檢測(cè)方法和血清學(xué)