鄭州地區(qū)孕婦感染B19病毒的調(diào)查和分離株全基因克隆及序列分析.pdf

1、背景與目的： 人微小病毒B19(Human Parvovirus B19)是目前已知的微小病毒科微小病毒屬中唯一使人類致病的病毒，也是動物病毒中體積最小結(jié)構(gòu)最簡單的DNA病毒。主要經(jīng)呼吸道和血液途徑傳播，可引起社區(qū)局部流行。自1990年首次證實我國存在該病毒感染后，陸續(xù)報告B19病毒是我國孕婦非免疫性流產(chǎn)、兒童急性再障危象、急性血小板減少性紫癜等疾病的重要病因之一。孕婦感染B19病毒者較容易通過垂直傳播，導(dǎo)致胎兒水腫、自然流產(chǎn)及

2、死胎。而在我國，多數(shù)婦女血清中缺少保護性抗體，易發(fā)生該病毒的感染?，F(xiàn)在一般診斷B19病毒感染多采用PCR與ELISA抗體檢測結(jié)合的方法。在鄭州地區(qū)，孕婦感染人微小病毒B19的情況尚無人報道。而且，國內(nèi)尚無B19病毒全基因序列的報道，對B19病毒序列分析也不多，我國B19流行株與國外B19病毒標(biāo)準(zhǔn)株基因差異的參考數(shù)據(jù)也不甚充足。因此，本研究應(yīng)用ELISA與PCR方法分別檢測血清B19 lgM抗體、B19 IgG抗體和B19-DNA，從而對

3、該地區(qū)孕婦感染人微小病毒B19做出判斷。同時，從B19病毒感染流產(chǎn)的孕婦血清中，用PCR方法擴增并克隆出病毒全基因，進行序列分析，為國內(nèi)B19病毒序列分析提供該地區(qū)的數(shù)據(jù)資料。 方法： 將收集的29例不明原因流產(chǎn)或死胎孕婦的血清設(shè)為觀察組，237例正常孕婦血清作為對照組。使用ELISA方法分別檢測血清標(biāo)本中的B19 IgG和IgM；提取血清標(biāo)本。DNA，以其為模板進行PCR檢測病毒感染情況。并利用統(tǒng)計學(xué)軟件對所得結(jié)果進行

4、統(tǒng)計學(xué)分析。 根據(jù)GenBank發(fā)表B19的全基因序列(NC_000883)設(shè)計7對重疊序列引物，所設(shè)計合成的重疊引物對應(yīng)擴增序列的總合囊括了參考序列的全序列；利用PCR和分子克隆鄭州地區(qū)孕婦感染B19病毒的調(diào)查和分離株全基因克隆及序列分析技術(shù)，從B19陽性的流產(chǎn)感染者血清標(biāo)本中分別擴增出預(yù)期B19病毒的7個互相重疊的區(qū)段：將其分別與pGEM-Teasy載體連接，轉(zhuǎn)化入JM109大腸桿菌中，利用氨芐青霉素抗性、藍(lán)白篩選篩選出陽性

5、克隆，并以PCR方法對陽性菌落進行鑒定，從而構(gòu)建出含B19病毒全基因的T載體克隆，并送測序分析。 結(jié)果： 1．29例不明原因流產(chǎn)或死胎孕婦血清B19 IgG、B19 IgM陽性率分別為51.7％(15/29)、6.9％(2/29)，237例正常孕婦對照組血清B19：lgG、B19 IgM陽性率分別為30.4％(72/237)、6.9％(2/29)。 2.29例不明原因流產(chǎn)或死胎孕婦血清中B19-DNAPCR檢測陽

6、性率為13.8％(4/29)；對照組檢測陽性率2.5％(6/237)。 3．分別成功構(gòu)建含有B19病毒7個互相重疊的片段的T載體重組克隆質(zhì)粒。 4．鄭州市B19病毒分離株與GenBank NC_000883比較顯示僅有10個核苷酸的不同，可導(dǎo)致2個不重要編碼氨基酸的改變。 結(jié)論： 血清中B19 IgG、IgM、B19-DNA陽性率與國內(nèi)外報道基本一致。鄭州地區(qū)孕婦中存在人微小病毒B19的感染。 鄭