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文檔簡介
1、食品安全已經(jīng)成為全世界共同關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。在各種食品安全事件中,由細(xì)菌引起的食源性疾病最多,涉及人數(shù)最廣。沙門氏菌、單增李斯特菌和大腸桿菌O157∶H7被認(rèn)為是牛肉中最重要的三種食源性致病菌??煽康臋z測技術(shù)是確定食物中病原菌的先決條件。傳統(tǒng)培養(yǎng)法操作繁瑣(富集、分離、鑒定),檢測時間較長,已經(jīng)不能滿足食品中致病菌快速靈敏檢測的需要,以核酸為基礎(chǔ)的多重PCR是一種快速、高靈敏度、特異性較強(qiáng)的檢測方法,能同時檢測多種食源性致病菌,有著廣
2、泛的應(yīng)用前景。本文對多重PCR法檢測牛肉中沙門氏菌、單增李斯特菌和大腸桿菌O157∶H7三種致病菌進(jìn)行了研究。
本研究通過預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出種或?qū)匍g特異性引物,并對其進(jìn)行特異性檢測。選用廣泛存在于沙門菌屬的侵襲蛋白基因invA作為檢測沙門菌屬的特異性基因;選用hlyA基因作為單增李斯特菌的毒力標(biāo)志基因;選用大腸桿菌O157的O抗原基因(rfbE)和鞭毛抗原基因(flic),建立了同時檢測三種食源性致病菌的多重PCR方法。在引物特異性
3、實(shí)驗(yàn)中,四對引物分別擴(kuò)增出大小為284 bp、456 bp、625 bp、812 bp的條帶。各目的基因及引物間沒有干擾,而其它非靶菌沒有非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象,證明引物具有很高的特異性。
對多重PCR體系中的Taq酶、dNTP、引物濃度、Mg2+和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化,最終確定多重PCR反應(yīng)體系為25μL:Mg2+4 mmol/L,dNTP0.4 mmol/L,Taq DNA聚合酶0.5 U,1μLDNA模板,沙門氏菌的引物終濃度為0
4、.2μmol/L,單增李斯特菌引物終濃度為0.1μmol/L,大腸桿菌O157∶H7引物終濃度為1μmol/L(flic)和0.3μmol/L(rfbE),剩下的用無菌水補(bǔ)至25μL。多重PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95℃預(yù)變性30 s;95℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸30 s,進(jìn)行35個循環(huán);最后72℃延伸7 min。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,多重PCR同時檢測三種食源性致病菌,沙門氏菌和單增李斯特菌靈敏度為101CFU/mL,大腸桿
5、菌O157∶H7靈敏度為102 CFU/mL;人工污染牛肉樣品經(jīng)18h富集培養(yǎng)后,沙門氏菌、大腸桿菌O157∶H7的檢出限為100 CFU/g,單增李斯特菌的檢出限為102 CFU/g。
通過比較試劑盒法、酚氯仿法和直接水煮法提取人工污染牛肉中三種致病菌的DNA,由電泳結(jié)果可知,試劑盒法的DNA提取效果明顯優(yōu)于酚氯仿法、直接水煮法。對比TSB和LB兩種增菌培養(yǎng)基的增菌效果,選出使三種目標(biāo)致病菌同時增菌的培養(yǎng)基。用LB增菌培養(yǎng)基
6、進(jìn)行前增菌,最低可同時檢出102CFU/g的三種致病,用TSB增菌培養(yǎng)基進(jìn)行前增菌,最低可同時檢出103CFU/g的三種致病。因此,選用LB作為三種致病菌的通用增菌培養(yǎng)基。
對實(shí)際樣品進(jìn)行檢測,并與國標(biāo)法進(jìn)行對比,結(jié)果表明,采用多重PCR方法簡單、快速,能同時檢測出牛肉中的一種或多種致病菌,具有較高的靈敏性、特異性和符合率。本研究建立的檢測牛肉樣品中的沙門氏菌、單增李斯特菌和大腸桿菌O157∶H7的多重PCR方法,為這三種病原
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